Диссоциация бактерий. Характеристика S-форм и R-форм, клиническое значение. Признаки колоний. Размеры колоний. Форма колоний. Форма краёв колоний. Диссоциации колоний. Цвет колоний

Способность живых организмов сохранять определенные признаки на протяжении многих поколений называется наследственностью.

В процессе изучения наследственности оказалось, что каждое последующее поколение под влиянием различных факторов может приобретать признаки, отличающие их от предыдущих поколений. Это свойство называется изменчивостью. Таким образом наследственность и изменчивость тесно связаны между собой.

Наука, изучающая наследственность и изменчивость живых организмов, называется генетикой (от греч. genos - рождение).

Еще в XIX веке Ч. Дарвин доказал, что все существующие виды живых организмов произошли путем изменчивости от немногих форм, а возникшие изменения, передаваемые по наследству, являются основой эволюционного процесса. Теория Дарвина получила высшую оценку у классиков марксизма-ленинизма. Ф. Энгельс рассматривал ее как одно из величайших открытий XIX века.

Изучение наследственности и изменчивости у высших организмов связано с большими трудностями из-за большой продолжительности их жизни и немногочисленности потомства.

Удобным объектом для этого изучения являются микроорганизмы, для которых характерен короткий жизненный цикл, быстрое размножение и способность давать многочисленное потомство. Кроме того, они обладают выраженной морфологией, которую можно изучать визуально при помощи светового микроскопа. Микроорганизмы биохимически активны, что легко учитывать при использовании специальных питательных сред.

Способность микроорганизмов изменять свои свойства при воздействии различных факторов (температура, ультрафиолетовое и рентгеновское излучение и др.) позволяет широко использовать их в качестве модели при изучении наследственности и изменчивости.

Первым объектом генетических исследований была кишечная палочка, которая хорошо культивируется в лабораторных условиях. Важное значение имело также то, что морфологические, культуральные и биохимические свойства этой бактерии хорошо изучены. В дальнейшем объектом генетических исследований стали и другие бактерии, а также вирусы.

Исследования генетики микроорганизмов показали, что у них роль носителя генетической информации играет ДНК (у некоторых вирусов РНК).

Молекула ДНК в бактериях состоит из двух нитей, каждая из которых спирально закручена относительно другой. При делении клетки нитчатая спираль удваивается- каждая из нитей служит как бы шаблоном или матрицей, на которой строится новая нить. При этом каждая нить, возникшая в процессе деления клеток, содержит вновь образовавшуюся двунитчатую молекулу ДНК.

В состав ДНК входят четыре азотистых основания - аденин, гуанин, цитозин и тимин, порядок расположения в цепи у разных организмов определяет их наследственную информацию, закодированную в ДНК.

Функциональной единицей наследственности является ген, который представляет собой участок нити ДНК. В генах записана вся информация, касающаяся свойств клетки.

Полный набор генов, которым обладает клетка, называется генотипом. Гены подразделяются на структурные, несущие информацию о конкретных белках, вырабатываемых клеткой, и гены-регуляторы, регулирующие работу структурных генов. Например, клетка вырабатывает те белки, которые необходимы ей в данных условиях, однако при изменении условий гены-регуляторы изменяют свойства клетки, приспосабливая их к новым условиям.

Изменения морфологических, культуральных, биохимических и других свойств микроорганизмов, возникающие под действием внешних факторов, взаимосвязаны. Например, изменения морфологических свойств сопровождаются обычно изменениями физиологических особенностей клетки.

В процессе изучения изменчивости микроорганизмов была обнаружена особая форма изменчивости - диссоциация. Этот вид изменчивости был описан П. де Крюи и Дж. Аркрайтом и выражается в том, что при посеве некоторых культур на плотные питательные среды происходит разделение колоний на два типа: гладкие, круглые, блестящие колонии с ровными краями - S-форма (от англ. smooth - гладкий), и плоские, непрозрачные колонии неправильной формы, с неровными краями - R-форма (от англ. rough - шероховатый). Существуют также переходные формы: М-формы (слизистые) и g-формы (карликовые).

Колонии, относящиеся к гладкой S-форме, могут при определенных условиях переходить в R-форму и обратно, однако переход R-формы в S-форму происходит труднее.

Диссоциация наблюдается у ряда бактерий, в частности у возбудителей сибирской язвы, чумы и др.

Характеристика S- и R-форм колоний S-форма R-форма Колонии гладкие, блестящие, Колонии неправильной формы, правильной выпуклой формы мутные, шероховатые При росте в бульоне - Растут в бульоне в виде осадка равномерная муть У подвижных бактерий жгутики У подвижных бактерий имеются могут отсутствовать жгутики Капсулы отсутствуют У капсульных бактерий имеется Биохимические свойства выражены капсула слабо Биохимически активны Большинство бактерий менее Болезнетворны болезнетворны Выделяются чаще в остром Выделяются обычно при хронической периоде заболевания форме заболевания

Болезнетворные бактерии чаще бывают в S-форме. Исключением являются возбудители туберкулеза, чумы, сибирской язвы, у которых болезнетворной является R-форма (рис. 26).

Изменения, возникающие в бактериальных клетках могут быть ненаследуемые - фенотипическая изменчивость и наследуемые - генотипическая изменчивость.

Фенотипическая изменчивость (модификация)

Модификация микроорганизмов возникает как ответ клетки на неблагоприятные условия ее существования. Это адаптивная реакция на внешние раздражители. Модификация не сопровождается изменением генотипа, в связи с чем возникшие в клетке изменения по наследству не передаются. При восстановлении оптимальных условий возникшие изменения утрачиваются. Модификация может касаться разных свойств микроорганизмов - морфологических, культуральных, биохимических и др.

Морфологическая модификация выражается в изменениях формы и величины бактерий. Например, при добавлении пенициллина к питательной среде клетки некоторых бактерий удлиняются. Недостаток в среде солей кальция вызывает у палочки сибирской язвы повышенное спорообразование. При повышенной концентрации солей кальция способность образовывать споры утрачивается и т. д. При длительном росте бактерий в одной и той же среде возникает полиморфизм, обусловленный влиянием накопившихся в ней продуктов их жизнедеятельности.

Культуральная модификация состоит в изменении культуральных свойств бактерий при изменении состава питательной среды. Например, при недостатке кислорода у стафилококка утрачивается способность образовывать пигмент. Чудесная палочка при комнатной температуре образует ярко-красный пигмент, но при 37° С способность образовывать этот пигмент утрачивается и т. д.

Биохимическая (ферментативная) модификация. Каждый вид бактерий имеет определенный набор ферментов, благодаря которым они усваивают питательные вещества. Эти ферменты вырабатываются на определенных питательных субстратах и предопределены генотипом.

В процессе жизнедеятельности бактерий обычно функционируют не все гены, ответственные за синтез соответствующих ферментов. В геноме бактерий всегда имеются запасные возможности, т. е. гены, определяющие выработку адаптивных ферментов. Например, кишечная палочка, растущая на среде, не содержащей углевод лактозу, не вырабатывает фермент лактазу, но если пересеять ее на среду с лактозой, то она начинает вырабатывать этот фермент. Адаптивные ферменты позволяют приспособляться к определенным условиям существования.

Таким образом, модификация - это способ приспособления микроорганизма к условиям внешней среды, обеспечивающий им возможность расти и размножаться в измененных условиях. Приобретенные свойства не передаются по наследству, поэтому они не играют роли в эволюции, а способствуют в основном выживанию микробных популяций.

Генотипическая (наследуемая) изменчивость

Генотипическая изменчивость может возникать в результате мутаций и генетических рекомбинаций.

Мутации (от лат. mutatio - изменять) - это передаваемые по наследству структурные изменения генов.

Крупные мутации (геномные перестройки) сопровождаются выпадением или изменением относительно крупных участков генома - такие мутации, как правило, необратимы.

Мелкие (точковые) мутации связаны с выпадением или добавлением отдельных оснований ДНК. При этом изменяется лишь небольшое число признаков. Такие измененные бактерии могут полностью возвращаться в исходное состояние (ревертировать).

Бактерии с измененными признаками называются мутантами. Факторы, вызывающие образование мутантов, носят название мутагенов.

Бактериальные мутации делят на спонтанные и индуцированные. Спонтанные (самопроизвольные) мутации возникают под влиянием неконтролируемых факторов, т. е. без вмешательства экспериментатора. Индуцированные (направленные) мутации появляются в результате обработки микроорганизмов специальными мутагенами (химическими веществами, излучением, температурой и др.).

В результате бактериальных мутаций могут отмечаться: а) изменение морфологических свойств; б) изменение культуральных свойств; в) возникновение у микроорганизмов устойчивости к лекарственным препаратам; г) потеря способности синтезировать аминокислоты, утилизировать углеводы и другие питательные вещества; д) ослабление болезнетворных свойств и т. д.

Если мутация приводит к тому, что мутагенные клетки обретают по сравнению с остальными клетками популяций преимущества, то формируется популяция из мутантных клеток и все приобретенные свойства передаются по наследству. Если же мутация не дает клетке преимуществ, то мутантные клетки, как правило, погибают.

Генетические рекомбинации . Трансформация. Клетки, которые способны воспринять ДНК другой клетки в процессе трансформации, называются компетентными. Состояние компетентности часто совпадает с логарифмической фазой роста.

Трансдукция - это перенос генетической информации (ДНК) от бактерии донора к бактерии реципиенту при участии бактериофага. Трансдуцирующими свойствами обладают в основном умеренные фаги. Размножаясь в бактериальной клетке, фаги включают в состав своей ДНК часть бактериальной ДНК и передают ее реципиенту. Различают три типа трансдукции: общую, специфическую и абортивную.

1. Общая трансдукция - это передача различных генов, локализованных на разных участках бактериальной хромосомы. При этом бактерии доноры могут передать реципиенту разнообразные признаки и свойства - способность образовывать новые ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

2. Специфическая трансдукция - это передача фагом только некоторых специфических генов, локализованных на специальных участках бактериальной хромосомы. В этом случае передаются только определенные признаки и свойства.

3. Абортивная трансдукция - перенос фагом какого-то одного фрагмента хромосомы донора. Обычно этот фрагмент не включается в хромосому клетки реципиента, а циркулирует в цитоплазме. При делении клетки реципиента этот фрагмент передается только одной из двух дочерних клеток, а второй клетке достается неизмененная хромосома реципиента.

С помощью трансдуцирующих фагов можно передать от одной клетки другой целый ряд свойств, таких как способность образовывать токсин, споры, жгутики, продуцировать дополнительные ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам и т. д.

Конъюгация - это передача генетического материала от одной бактерии к другой при непосредственном контакте клеток. Клетки, передающие генетический материал, называются донорами, воспринимающие его - реципиентами. Этот процесс носит односторонний характер - от клетки донора к клетке реципиента.

Бактерии донора обозначаются F+ (мужской тип), а бактерии реципиента - F- (женский тип). При тесном сближении клеток F+ и F- между ними возникает цитоплазматический мостик. Образование мостика контролируется фактором F (от англ. fertility - плодовитость). Этот фактор содержит гены, ответственные за образование половых ворсинок (sex-pili). Функцию донора могут выполнять только те клетки, которые содержат фактор F. Клетки реципиента лишены этого фактора. При скрещивании фактор F передается клеткой донора реципиенту. Получив фактор F, женская клетка сама становится донором (F+).

Процесс конъюгации можно прервать механическим способом, например встряхиванием. В этом случае реципиент получает неполную информацию, заключенную в ДНК.

Перенос генетической информации путем конъюгации лучше всего изучен у энтеробактерий.

Конъюгация, как и другие виды рекомбинации, может осуществляться не только между бактериями одного и того же вида, но и между бактериями разных видов. В этих случаях рекомбинация называется межвидовой.

Плазмиды

Плазмиды - это сравнительно небольшие внехромосомные молекулы ДНК бактериальной клетки. Они расположены в цитоплазме и имеют кольцевую структуру. В плазмидах содержится несколько генов, функционирующих независимо от генов, содержащихся в хромосомной ДНК.

Типичным признаком плазмид служит их способность к самостоятельному воспроизведению (репликации).

Они могут также переходить из одной клетки в другую и включать в себя новые гены из окружающей среды. К числу плазмид относятся:

Профаги , вызывающие у лизогенной клетки ряд изменений, передающихся по наследству, например способность образовывать токсин (см. трансдукцию).

F-фактор , находящийся в автономном состоянии и принимающий участие в процессе конъюгации (см. конъюгацию).

R-фактор , придающий клетке устойчивость к лекарственным препаратам (впервые R-фактор был выделен из кишечной палочки, затем из шигелл). Исследования показали, что R-фактор может быть удален из клетки, что вообще характерно для плазмид.

R-фактор обладает внутривидовой, межвидовой и даже межродовой трансмиссивностью, что может явиться причиной формирования трудно диагностируемых атипичных штаммов.

Бактериоциногенные факторы (col-факторы) , которые впервые были обнаружены в культуре кишечной палочки (Е. coli), в связи с чем названы колицинами. В дальнейшем они были выявлены и у других бактерий: холерного вибриона - вибриоцины, стафилококков - стафилоцины и др.

Col-фактор - это маленькая автономная плазмида, которая детерминирует синтез белковых веществ, способных вызывать гибель бактерий собственного вида или близкородственного. Бактериоцины адсорбируются на поверхности чувствительных клеток и вызывают нарушения метаболизма, что приводит клетку к гибели.

В естественных условиях только единичные клетки в популяции (1 на 1000) спонтанно продуцируют колицин. Однако при некоторых воздействиях на культуру (обработка бактерий УФ-лучами) количество колицинпродуцирующих клеток увеличивается.

Практическое значение изменчивости

Еще Пастер искусственным путем получил необратимые изменения у возбудителей бешенства, сибирской язвы и приготовил вакцины, предохраняющие от этих заболеваний. В дальнейшем исследования в области генетики и изменчивости микроорганизмов позволили получить большое число бактериальных и вирусных штаммов, используемых для получения вакцин.

Результаты исследования генетики микроорганизмов с успехом были использованы для выяснения закономерностей наследственности высших организмов.

Большое научное и практическое значение имеет также новый раздел генетики - генная инженерия.

Методы генной инженерии позволяют изменять структуру генов и включать в хромосому бактерий гены других организмов, ответственных за синтез важных и нужных веществ. В результате микроорганизмы становятся продуцентами таких веществ, получение которых химическим путем представляет очень сложную, а иногда даже невозможную задачу. Этим путем в настоящее время получают такие медицинские препараты, как инсулин, интерферон и др. При использовании мутагенных факторов и селекции были получены мутанты-продуценты антибиотиков, которые в 100-1000 раз активнее исходных.

Контрольные вопросы

1. Что является функциональной единицей наследственности?

2. Какова роль генов-регуляторов?

3. Что такое диссоциация и какие Вы знаете формы диссоциации?

4. Что значит фенотипическая изменчивость и какими свойствами она может быть выражена?

5. Что значит генотипическая изменчивость и какими формами она может быть выражена?

6. Что такое плазмиды?

7. Какое практическое значение имеет изменчивость?

К культуральным или макроморфологическим свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные, глубинные и донные колонии.
Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой принадлежности исследуемой культуры.
При описании колоний учитывают следующие признаки:

• форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная, неправильная и т.д.;
• размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);
• поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с концентрическими кругами или радиально исчерченная;
• профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.;
• прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;
• цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая, золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее окрашиванием;
• край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;
• структура колонии - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая; край и структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;
• консистенция колонии - определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония может быть плотной, мягкой, врастающей в агар, слизистой (тянется за петлей), хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).

Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.
Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по дну.
Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает его особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ровным или волнистым краем; диффузный; перистый; ризоидный; древовидный. Характеризуют цвет, поверхность, консистенцию.
Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава среды, температуры культивирования.
Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя 4-7 суточные культуры, выращенные в стационарных условиях.
В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается помутнение среды, образование пленки или осадка.

• Рост бактерий с равномерным помутнением среды, что характерно для факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная, сильная.
• Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного, обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда может быть прозрачной или мутной.
• Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной.
• Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой, кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивирован ии аэ робных бактерий.

При росте на полужидких (0,5-0,7% агара) питательных средах подвижные микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по ходу посева уколом в среду.
Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий связан с образованием различных эфиров (уксусноэтилового, уксусноамилового и др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.
Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды, антоцианы, меланины. Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет, если же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене веществ этих микроорганизмов.
В природе существуют, так называемые, фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Такие бактерии встречаются, главным образом, в речной или морской воде. К светящимся бактериям - фотобактериям - относятся аэробные бактерии (вибрионы, кокки, палочки).

Выделение чистых культур микроорганизмов

Чистой культурой называют такую культуру, которая содержит микроорганизмы одного вида. Выделение чистых культур бактерий - обязательный этап бактериологического исследования в лабораторной диагностике инфекционных болезней, в изучении микробной загрязненности различных объектов окружающей среды, и, в целом, при любой работе с микроорганизмами. Исследуемый материал (гной, мокрота, фекалии, кровь и другой материал от больных; вода, почва, воздух, пищевые продукты, трупы животных и человека, переносчики) обычно содержит ассоциации микробов.
Выделение чистой культуры позволяет изучить морфологические, культуральные, биохимические, антигенные и другие признаки, по совокупности которых определяется видовая и типовая принадлежность возбудителя, то есть производится его идентификация.
Для выделения чистых культур микроорганизмов используют методы, которые можно разделить на несколько групп.

• Метод Пастера - последовательное разведение исследуемого материала в жидкой питательной среде до концентрации одной клетки в объеме (имеет историческое значение).
• Метод Коха («пластинчатые разводки») - последовательное разведение исследуемого материала в расплавленном агаре (температура 48-50 ° С), с последующим разливом в чашки Петри, где агар застывает. Высевы делают, как правило, из трех-четырех последних разведений, где бактерий становится мало и, в дальнейшем, при росте на чашках Петри появляются изолированные колонии, образующиеся из одной исходной материнской клетки. Из изолированных колоний в глубине агара получают чистую культуру бактерий пересевом на свежие среды.
• Метод Шукевича - применяется для получения чистой культуры протея и других микроорганизмов обладающих «ползущим» ростом. Посев исследуемого материала производят в конденсационную воду у основания скошенного агара. Подвижные микробы (протей) способны подниматься вверх по скошенному агару, неподвижные формы остаются расти внизу на месте посева. Пересевая верхние края культуры можно получить чистую культуру.
• Метод Дригальского - широко применяется в бактериологической практике, при этом исследуемый материал разводят в пробирке стерильным физиологическим раствором или бульоном. Одну каплю материала вносят в первую чашку и стерильным стеклянным шпателем распределяют по поверхности среды. Затем этим же шпателем (не прожигая его в пламени горелки) делают такой же посев во второй и третьей чашках. С каждым посевом бактерий на шпателе остается все меньше и меньше и, при посеве на третью чашку, бактерии будут распределяться по поверхности питательной среды отдельно друг от друга. Через 1-7 сут выдерживания чашек в термостате (в зависимости от скорости роста микроорганизмов) на третьей чашке каждая бактерия дает клон клеток, образуя изолированную колонию, которую пересевают на скошенный агар с целью накопления чистой культуры.
• Метод Вейнберга. Особые трудности возникают при выделении чистых культур облигатных анаэробов. Если контакт с молекулярным кислородом не вызывает сразу же гибели клеток, то посев производят по методу Дригальского, но после этого чашки сразу помещают в анаэростат. Однако чаще пользуются методом разведения. Сущность его заключается в том, что разведения исследуемого материала проводят в расплавленной и охлажденной до 45-50 ° С агаризированной питательной среде. Делают 6-10 последовательных разведений, затем среду в пробирках быстро охлаждают и заливают поверхность слоем смеси парафина и вазелинового масла, чтобы помешать проникновению воздуха в толщу питательной среды. Иногда питательную среду после посева и перемешивания переносят в стерильные трубки Бурри или капиллярные пипетки Пастера, концы которых запаивают. При удачном разведении в пробирках, трубках Бурри, пипетках Пастера вырастают изолированные колонии анаэробов. Чтобы изолированные колонии хорошо были видны, используют осветленные питательные среды. Для извлечения изолированных колоний анаэробов, пробирку слегка нагревают, вращая ее над пламенем, при этом агар, прилегающий к стенкам, плавится и содержимое пробирки в виде агарового столбика выскальзывает в стерильную чашку Петри. Столбик агара разрезают стерильным пинцетом и извлекают колонии петлей. Извлеченные колонии помещают в жидкую среду, благоприятную для развития выделяемых микроорганизмов (например, среду Китта-Тароцци). Агаризированную среду из трубки Бурри выдувают, пропуская газ через ватную пробку.
• Метод Хангейта - когда хотят получить изолированные колонии бактерий с особенно высокой чувствительностью к кислороду (ст рогие аэробы) используют метод вращающихся пробирок Хангейта. Для этого расплавленную агаризированную среду засевают бактериями при постоянном токе через пробирку инертного газа, освобожденного от примеси кислорода. Затем пробирку закрывают резиновой пробкой и помещают горизонтально в зажим, вращающий пробирку, среда при этом равномерно распределяется по стенкам пробирки и застывает тонким слоем. Применение тонкого слоя в пробирке, заполненной газовой смесью, позволяет получить изолированные колонии, хорошо видимые невооруженным глазом.
• Выделение отдельных клеток с помощью микроманипулятора. Микроманипулятор - прибор, позволяющий с помощью специальной микропипетки или микропетли извлекать одну клетку из суспензии. Эту операцию контролируют под микроскопом. На предметном столике микроскопа устанавливают влажную камеру, в которую помещают препарат «висячая капля». В держателях операционных штативов закрепляют микропипетки (микропетли), перемещение которых в поле зрения микроскопа осуществляется с микронной точностью благодаря системе винтов и рычагов. Исследователь, глядя в микроскоп, извлекает отдельные клетки микропипетками и переносит их в пробирки со стерильной жидкой средой для получения клона клеток.



Бактериальная колонизация – заселение ареала и образование микробного сообщества.

В лабораторных условиях колонизация - рост бактерий в виде колоний (отдельных округлых образований на плотных питательных средах (ППС).

В естественных условиях рост бактерий происходит в виде биопленок (рост на поверхности ППС).

По скорости своего размножения бактерии превосходят все другие организмы. В благоприятных условиях бактерии могут делится каждые 20 мин, образуя огромные по численности колонии.

При недостатке питательных веществ рост колонии бактерий останавливается. Многие бактерии при этом начинают образовывать споры, которые служат для сохранения особей, а не для размножения. Образуя спору, бактерия вырабатывает очень плотную оболочку. Споры предотвращают высыхание бактерии, способны переносить низкую или высокую температуры. Споры могут сохранять жизнеспособность сотни лет.

49. Особенности строение и функции бактериальной биопленки

В настоящее время признано, что большинство микроорганизмов в естественных и искусственно созданных окружающих средах существует в виде структурированных, прикрепленных к поверхности сообществ – биопленок.

Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ

Этапы образования биопленки:

Обратимая адгезия

Необратимая (рецепторно - опосредованная) адгезия (экзополисахариды)

Созревание биопленки

экспрессия генов, отвечающих за синтез сигнальных молекул:

Гр(+) - ацил-гомосериновые лактоны,

Гр(-)- короткоцепочечные пептиды

Состав матрикса: полисахариды микроорганизма и кислые полисахариды (муцин – продуцирует макроорганизм),

Феномен взаимодействия между бактериями получил название «quorum sensing или «чувство кворума

QS - бактериальный язык общения

(образование биопленок, патогенность, синтез антибиотиков)

Продукция экзогенных факторов патогенности бактериями в составе биопленок происходит только по достижению ими определенной критической массы бактериальных клеток, достаточных для преодоления защитных механизмов организма и успешного развития инфекционного процесса.

Доказана роль микробных биопленок в возникновении и развитии таких распространенных заболеваний, как:

инфекции, связанных с катетеризацией сосудов, вызванные Staphylococcus aureus и др. грамположительными микроорганизмами

инфекции сердечных клапанов и суставных протезов, вызываемые стафилококками

пародонтит, вызываемый рядом микроорганизмов полости рта

инфекции мочевыводящих путей, вызываемые Е. col i и др. патогенами,

инфекции среднего уха, вызываемые, например Haemophilus influenzae

Экологические преимущества биопленок

Облегчение доступа питательных веществ и метаболическая кооперация

Защита от негативных воздействий окружающей среды

Резистентность к антибактериальным агентам

Резистентность к антибактериальным агентам:

инактивация антибиотиков внеклеточными полимерами или ферментами,

замедлением метаболизма и, соответственно, уменьшение скорости роста микроорганизмов в условиях лимитирования питательных веществ в биопленке, из-за чего антибактериальный препарат диффундирует из биопленки быстрее, чем успеет на них подействовать,

экспрессия возможных генов резистентности

возникновение в биопленке под воздействием антибиотиков микроорганизмов-персистентов

Стратегии преодоления резистентности и борьбы с биопленками:

предотвращение первичного инфицирования имплантата,

минимизация начальной адгезии микробных клеток,

разработка методов проникновения через матрикс биопленки различных биоцидов с целью подавления активности связанных биопленкой клеток

разрушение матрикса

Своеобразной формой изменчивости является R-S-диссоциация бактерий. Она возникает спонтанно вследствие образования двух форм бактериальных клеток, которые отличаются друг от друга по характеру образуемых ими колоний на твердой питательной среде. Один тип - R-ко лонии (англ. rough - неровный) - характеризуется неровными краями и шероховатой поверхностью, второй тип - S-колоний (англ. smooth- гладкий)- имеет круглую форму, гладкую поверхность. Процесс диссоциации, т.е. расщепления бактериальных клеток, формирующих оба типа колоний, обычно протекает в одном направлении: от S- к R-форме , иногда через промежуточные стадии образования слизистых колоний. Обратный переход R- в S-форму наблюдается реже . Для большинства вирулентных бактерий характерен рост в виде S-формы колоний. Исключение составляют микобактерии туберкулеза, иерсинии чумы, сибиреязвенные бактерии и некоторые другие, которые растут в R-форме.

В процессе диссоциации одновременно с изменением морфологии колоний меняются биохимические, антигенные, патогенные свойства бактерий, их устойчивость к физическим и химическим факторам внешней среды.

Мутации, которые приводят к S-R-диссоциации, относятся к инсертационным, поскольку они возникают после встраивания внехро-мосомных факторов наследственности, в том числе и умеренных фагов в бактериальную хромосому. Если эта мутация приводит к утрате генов, контролирующих образование детерминантных полисаха-ридных звеньев ЛПС у грамотрицательных бактерий, то образуются R-мутанты. Они формируют шероховатые колонии, изменяют свои антигенные свойства и резко ослабляют патогенность. У дифтерийных бактерий S-R-диссоциация связана с их лизогенизацией соответствующими бактериофагами. При этом R-формы образуют токсин. У других бактерий R-формы возникают после интеграции в их хромосому R-плазмиды, транспозонов или Is-последовательностей. R-формы пиогенных стрептококков и ряда других бактерий образуются в результате рекомбинаций.

Биологическое значение S-R-диссоциации состоит в приобретении бактериями определенных селективных преимуществ, обеспечивающих их существование в организме человека или во внешней среде. К ним относится более высокая устойчивость S-форм к фагоцитозу макрофагами, бактерицидному действию сыворотки крови. R-формы обладают большей устойчивостью к факторам окружающей среды. Они более длительное время сохраняются в воде, молоке.

Вместе с тем S-R-диссоциация во многих случаях усложняет бактериологическую диагностику ряда инфекционных заболеваний, например дизентерии Зонне, эшерихиоза, вызванного Е. coli О124 и др.

ДИССОЦИАЦИЯ БАКТЕРИЙ (лат. dissociatio разделение, разъединение) - возникновение в популяции бактерий особей, дающих начало новым клонам, отличающимся от исходного типа внешним видом и структурой колоний, а также наследственно закрепленными изменениями некоторых морфол., физиол, и биохим, признаков. При этих изменениях основные таксономические характеристики данного вида обычно сохраняются.

Термин «диссоциация» в микробиологии впервые применил де Крюи (P. de Kruif, 1921), наблюдавший расщепление культуры возбудителя кроличьей септицемии на вирулентные и авирулентные варианты. Аркрайт (J. Arkwright, 1921) установил у бактерий родов Shigella (см.) и Salmonella (см.) различия диссоциативных форм по характеру колоний, последовательности возникающих изменений на плотных и жидких питательных средах, изменения антигенных свойств и вирулентности.

Диссоциация известна у многих видов бактерий, а также у грибков, дрожжей, водорослей. Обычно она выявляется в стареющих культурах, при субоптимальных условиях развития данного вида микроорганизмов. Наиболее полно процесс диссоциации изучен при культивировании бактерий в искусственной среде. Д. б. возникает и в природных условиях (у патогенных бактерий в живом организме) под влиянием бактериофагов, продуктов метаболизма, отклонений от оптимальных значений pH, повышенной концентрации солей, неоптимальной температуры, специфических антимикробных сывороток и др.

В условиях эксперимента Д. б. можно вызвать (или интенсифицировать ее фенотипическое выражение) воздействием мутагенов (см.) - ионизирующих излучений, производных иприта, ДНК-тропных препаратов и др.

Признаком Д. б., доступным наблюдению, является изменение морфологии колоний на плотной питательной среде. Эти изменения типичны для филогенетически родственных групп микроорганизмов и, как правило, необратимы. Обычно за норму принимают характер роста культуры при рассеве на плотной среде в виде блестящих, гладких колоний маслянистой консистенции - S-формы (англ. smooth гладкий), в отличие от шероховатых или складчатых R-колоний (англ. rough грубый, шероховатый), характеризующих резко выраженный процесс диссоциации. Структурные различия этих основных типов колоний, наблюдающихся при диссоциации большинства бактерий, определяются физ.-хим. факторами (состав среды, условия роста и развития), а также особенностями измененных клеток, при делении различно перемещающихся относительно друг друга. В зависимости от типа деления и силы сцепления клеточных элементов проявляется рыхлость строения и мутантность поверхности колоний у R-вариантов (табл.). Типы деления клеток изучены при помощи цейтрайферной киносъемки (см. Кинематография в медицине) у развивающихся колоний кишечных бактерий (В. Л. Троицкий и 3. Г. Першина). Для гладких S-коло-ний характерен «скользящий» тип деления, при к-ром новые клетки плотно прилегают одна к другой и как бы скользят вдоль формирующихся тяжей из разделившихся, но не разомкнувшихся особей (рис. 1).

R-колонии образуются при замедленном разделении укрупненных клеток, складывающихся в виде неэластичных цепочек, при скоплении в популяции дающих характерные «изломы», что отражается и на особенностях макроструктуры колоний (рис. 2). Диссоциированную культуру легко отличить и по росту в жидкой питательной среде. Для гладкой формы типично равномерное помутнение среды, за к-рым следует образование вязкого осадка, при встряхивании поднимающегося в виде косы; развитие в жидкой среде шероховатой формы бактерий характеризуется образованием крошковатого придонного осадка и иногда такого же пристеночного роста; среда при этом остается прозрачной, а на поверхности может образоваться пылевидная, а затем морщинистая пленка.

При суспендировании в физиол, р-ре диссоциированных бактерий, выросших на плотной среде, также выпадает крошковатый осадок, особенно интенсивный при нагревании суспензии.

Представления о S-формах как о нормальных, типичных и R-формах- как о неполноценных, дегенеративных применимы не ко всем видам бактерий. Так, для микобактерий туберкулеза, бацилл сибирской язвы, картофельной и сенной палочек, так же как для многих видов грибков, нормальным является шероховатая структура колоний на плотной среде и соответствующий тип роста в жидкой среде, остающейся прозрачной.

В процессе диссоциации у большинства патогенных микроорганизмов снижается токсичность или вирулентность. Однако бывают исключения. Так, напр., у стрептококков наблюдаются обратные соотношения. Вирулентными оказываются матовые, неблестящие колонии, для которых предложен термин «mat», и авирулентными - блестящие, гладкие [«glossy» по Тодду и Лансфилд (E. W. Todd, R. S. Lancefield, 1928)].

У многих бактерий известна промежуточная форма колоний между S и R - слизистая, М-форма (англ. mucoid), однако она нестабильна. Для некоторых видов бактерий, кроме названных, применяются также обозначения: D - карликовая форма (англ. dwarf карлик) и G - гонидиальная форма (англ. gonidial).

По типу изменений соматического (О) и жгутикового (Н) антигенов диссоциированных форм применяются также обозначения типов колоний О и H или переходного - ОН. В соответствии с общепринятыми обозначениями типов колоний общеприняты следующие характеристики их: S-форма - круглые, выпуклые, с ровным краем (рис. 3), прозрачные или опалесцирующие в проходящем свете, гомогенные, с блестящей поверхностью; R-форма - более плоские колонии, часто неправильной формы с бахромчато-извилистым краем и складчатой «гирозной» поверхностью (рис. 4 и 5); М-форма - влажные, слизистые колонии, часто окаймленные слизистым валиком (рис. 6), сливающимся затем в общую массу вязкой консистенции, тянущуюся за движением платиновой петли. D- и G-формы по внешней характеристике идентичны. Это очень мелкие, карликовые, колонии, развивающиеся нередко в виде так наз. дочерних новообразований преимущественно по краю нормально развитых колоний или изолированно от них (рис. 7). В последующих генерациях при оптимальных условиях культивирования они постепенно укрупняются до нормальной величины и приобретают форму, типичную для данного вида бактерий.

Изменения внешнего вида колоний не всегда свидетельствуют об истинной диссоциации; они могут быть следствием изменения состава питательной среды и других факторов, отклоняющих условия культивирования от оптимальных и ведущих к временным модификациям, исчезающим при культивировании в нормальных условиях.

Для дифференцирования S- и R-диссоциативных форм бактерий применяют трипафлавиновую пробу Пампаны. Ее проводят по типу капельной агглютинации (см.) на предметном стекле, на к-рое наносят р-р трипафлавина (1: 1000-1: 2000); в нем суспендируется взвесь микробов в 0,9% изотоническом р-ре хлорида натрия. Микробы, находящиеся в R-форме, склеиваются, образуют конгломераты, подобно агглютинации специфической сывороткой, просветляя р-р красителя. S-микробные клетки образуют гомогенную мутную взвесь. Для дифференцирования диссоциативных форм бактерий в микрокультурах Ульбрих (F. Ulbrieh, 1957) предложил прижизненную окраску кристалл-виолетом в разведении 1: 2000. При обработке в течение 20 сек. S- и R-варианты воспринимают краситель различно.

Изменение культуральных, физиол., физ. -хим., адсорбционных свойств диссоциированных бактерий связано с особенностями полисахаридолипоидных компонентов микробных клеток, составляющих «полный антиген» по Буавену, или соматический О-антиген. В нормальном состоянии эти компоненты легко обнаруживаются у гладких вариантов большинства грамотрицательных и многих грамположительных бактерий и не выявляются у R-вариантов. Основными свойствами полных (О) антигенов у патогенных микробов являются высокая специфичность и токсичность, связанные с вирулентностью, токсигенностью и способностью стимулировать выработку специфических антител при иммунизации животных. Потеря вирулентности и атоксичность R-вариантов связывается с утратой или извращением способности синтеза липополисахаридов. Относительное увеличение белковых компонентов при редуцировании полисахаридолипоидных обусловливает повышенную гидрофобноcть микробных клеток и склонность их к выпадению в осадок из солевых р-ров при нагревании или в присутствии некоторых основных красителей.

Те же изменения физ.-хим. свойств поверхностных компонентов микробной клетки приводят к утрате специфической агглютинабельность! R-форм бактерий и замене ее «серологическим космополитизмом»- термин, введенный Шютце (R. Schutze, 1922) в отношении сальмонеллезных бактерий. Сущность его заключается в том, что R-культура в начальном периоде развития агглютинируется почти до титра сыворотками R-типа других родственных видов и не агглютинируется S-антисы-воротками тех же микробов. Утрата видовой серол, специфичности молодых культур и спонтанная агглютинабельность старых не позволяют использовать серол, тесты для идентификации диссоциированных форм бактерий.

Однако при Д. б. основные сахаролитические свойства (ферментация углеводов), морфол, и тинкториальные характеристики, как правило, сохраняются без изменений, хотя возможны и исключения. Так, известны факты повышения ферментативной активности R-форм уксуснокис лых бактерий и изменение свойств у некоторых продуцентов антибиотиков.

В смешанных S - R-популяциях и чистых линиях R-вариантов бактерий возможны реверсии в исходную S-форму, происходящие с различной частотой. Генетическая природа диссоциативного процесса связана с хромосомными мутациями генов (см. Мутация), контролирующих синтез специфических антигенов. На сальмонеллезных бактериях удалось провести генетический анализ структуры детерминант соматического антигена [Стокер (В. A. D. Stocker) и соавт., 1971]. При помощи серии мутантов, имеющих повреждения в различных локусах хромосомы, картированы гены, ответственные за синтез компонентов, составляющих структуру ядра соматического антигена, контролирующие синтез боковых цепей полисахаридной природы, характер и длина которых определяют способность к специфической агглютинации. Так. при наличии мутации в локусе rfa полностью утрачивается способность синтеза соматического антигена; мутация в локусе rfb ведет к утрате синтеза боковых цепей при сохранении компонентов ядра соматического антигена; мутации типа rfc выражаются в образовании клеток промежуточной S -R-формы, О-антиген которых содержит нормальное ядро и короткие полисахаридные цепочки; за счет последних может осуществляться специфическая агглютинация.

Теоретические обоснования циклического развития и закономерной смены фаз диссоциации - теория циклогении по Хедли - представляют исторический интерес, хотя фактические данные и детальное описание фенотипического выражения изменений микробных популяций, связанных с процессом диссоциации, не утратили своего значения (см. Бактерии, физиология). Наблюдавшееся спонтанное восстановление R-форм популяции в исходную S-форму сторонники теории цикло-гении рассматривали в качестве физиол. нормального цикла развития через промежуточные фазы - S-О-M-R-S (по М. И. Штуцеру, 1930). Исследователи, применявшие в качестве критерия оценки Д. б. изменения в антигенном строении, связанном с утратой полисахаридолипоидных компонентов, считали переход из S- в R-форму необратимым. Объективно частичная или полная реверсия в исходное S-состояние - процесс закономерный; он может быть в определенных условиях стимулирован. Так, показана возможность реверсии R-вариантов в S-фор-мы при выращивании бактерий на средах, содержащих убитые S-бактерии, или при введении смеси S- и R-форм в организм лабораторного животного. На тип изменений в свойствах бактерий при диссоциации могут влиять накапливающиеся в среде метаболиты, угнетающие развитие нормальных форм и стимулирующие рост R-вариантов, менее чувствительных или резистентных к действию этих метаболитов. Примером может служить влияние D-аланина, способствующего развитию R-вариантов бруцелл, резистентных к действию его высоких концентраций, и значение валина, способствующего развитию мукоидных форм тех же.бактерий. В присутствии гликокола, лейцина большинство R-клеток популяции В. brevis (вариант G-В) трансформмировалось в S-форы. Наличие в синтетической среде валина способствовало процессу диссоциации бактерий того же вида (Г. Г. Жарикова и др., 1971). Важным фактором, направляющим процесс диссоциации в условиях лабораторного культивирования бактерий, является селекционирующее влияние среды, изменяющейся в зависимости от особенностей метаболизма определенных групп микроорганизмов и интенсивности обмена на разных этапах развития микробной популяции.

Правильное представление о Д. б. имеет практическое значение для предотвращения дегенеративных изменений в свойствах ценных типовых культур или штаммов продуцентов в производстве бактерийных препаратов, поэтому основные признаки, характеризующие бактерии в S- и R-формах, сохраняют значение. Кроме различий, указанных в таблице, R-формы кишечных бактерий отличаются от S-форм большей устойчивостью к УФ-лучам, выраженными антикомплементарными свойствами (см. Комплемент) и высокой резистентностью к бактериолизинам нормальной сыворотки крови. Степень и характер диссоциативных изменений популяции бактерий могут быть определены с использованием современных методов генетического анализа мутационных изменений и их фенотипической экспрессии. Феноменологические данные и микробиол, тесты идентификации основных диссоциативных форм бактерий сохраняют свое значение при диагностических исследованиях.

Таблица. Основные признаки диссоциированных бактериальных культур в S- и R-фазах по Хедли (P. HADLEY)

S-нормальный тип	R-мутантный тип
Гомогенный рост в бульоне	Агглютинативный рост в бульоне
Нормальная суспензия в 0,9% р-ре NaCl	Выпадение осадка в 0,9% р-ре NaCl
Ограниченный рост на агаре	Часто расползающийся рост на агаре
Колонии гладкие, правильной формы, выпуклые	Колонии шероховатые, неправильной формы, плоские
Может давать дочерние колонии	Дочерние колонии возникают редко
Рост на агаре сочный	Рост на агаре плотнее
Рост на агаре флюоресцирующий	Рост на агаре редко флюоресцирующий
Рост на агаре пигментирующий	Рост на агаре непигментирующий
Подвижность активная у подвижных организмов	Подвижность исчезает
Капсулы у капсулообразователей	Капсулы отсутствуют
Биохимически более активны	Биохимически менее активны
Носители двойных антигенов	Часто только R-антигены
Обладают специфическим растворимым веществом	Не обладают специфическим растворимым веществом
Агглютинация в форме выпадения хлопьев, зерен	Мелкозернистая агглютинация
В случае патогенных бактерий более вирулентны или токсичны	Слабо вирулентны или совсем невирулентны
Чаще встречаются в течение активного заболевания	Больше встречаются у носителей и выздоравливающих
Чаще встречаются при остром течении болезни	Чаще встречаются при хроническом течении болезни
Погибают в старых культурах	Устойчивы в старых культурах
Чувствительны к бактериофагу	Менее чувствительны к бактериофагу
Свободноживущие формы	Результат приспособляемости
Клетки нормальной морфологии	Наклонность к образованию коротких палочек и кокков
Переход в О- и R-форму в S-иммунной сыворотке	Не изменяются в S-иммунной сыворотке
Резистентен к фагоцитозу	Поддаются фагоцитозу

Библиография: Готовцева В. А., Гусакова Е. Г. и Коровкина А. С. О диссоциации культуры Mycobacterium globiforme 193 на S- и R-формы, Микробиология, т. 37, в. 3, с. 505, 1968; Ш а-р и к о в а Г. Г. и МаркеловаС. И. Диссоциация R и Р + вариантов В. brevis var. G В при развитии на синтетической среде с аминокислотами в качестве единственного источника азота, Антибиотики, т. 16, № 3, с. 265, 1971; Штуцер М. И. Очерк учения о диссоциации и цикле развития бактерий, Журн. микр. и иммун., т. 7, в. 2, с. 129, 1930, библиогр.; BertschingerH. U. Disso-ziationsbedingte serologische Kreuzreak-tionen bei Schweine-Enterotoxamia-Koli-typen, Path, et Microbiol. (Basel), Bd 36, S. 215, 1971; B i s s e t K. A. a. S t r e-e t J. Morphological phases in the swarm of bacillus licheniformis, J. gen. Microbiol., v. 76, p. 369, 1973; H a d 1 e у P. Micro-bis dissociation, J. infect. Dis., v. 40, p. 1, 1927.