Антигены эритроцитов, определение полных и неполных антител, кровь. Плазма крови. антигенные свойства эритроцитов

Аллоиммунные антитела – антитела к антигенам эритроцитов. Основные показания к применению: профилактика резус-конфликта при беременности, невынашивание беременности, гемолитическая болезнь новорожденных, переливание крови с целью профилактики посттрансфузионных осложнений.

В эритроцитах человека содержится большое количество групповые антигенов, образующих групповые системы, состоящие из одной или нескольких пар антигенов. Известны такие групповые системы крови, как - АВ0, резус-фактор, Келл, Левис (Lewis), Кидд, MNSs, Даффи, Диего и другие.
Аллоиммунные антиэритроцитарные антитела - антитела к резус-фактору и другим эритроцитарным антигенам, появляющиеся в крови после переливания несовместимой донорской крови или при беременности. Появление в сыворотке крови аллоиммунных антител свидетельствует о сенсибилизации организма и увеличения риска осложнений при переливании несовместимой крови, наличии риска невынашивания беременности и развитии гемолитической болезни плода у резус-отрицательной женщины при резус–положительной крови у плода.
Резус - антитела относятся к так называемым аллоиммунным антителам, поскольку появляются в крови резус - отрицательных людей лишь при особых условиях. Условиями, способствующими образованию резус - антител, являются введение резус - отрицательному человеку резус - положительной крови или беременность резус - отрицательной женщины резус - положительным плодом. Аллоантитела содержатся в сыворотке индивида и не взаимодействуют с антигенами собственных эритроцитов. Они взаимодействуют с антигенами эритроцитов других пациентов после переливания крови или при беременности.
Определение резус - антител наряду с определением резус - принадлежности больного и донора необходимо для предупреждения переливания резус - несовместимой крови, а также для диагностики возможного заболевания плода или новорожденного гемолитической болезнью. Определение резус - антител требуется также при подготовке материла в целях использования для приготовления сывороток антирезус. Резус - антитела бывают разные по специфичности: анти-D, анти-С, анти-Е, анти-с, анти-е; и по форме: полные и неполные. Специфичность антител определяется тем, с каким из антигенов они реагируют. Форма антител определяется тем, каким образом они реагируют с эритроцитами, содержащими специфические для них резус - антигены. Полные антитела, соединяясь с резус - антигенами эритроцитов, вызывают агглютинацию этих эритроцитов при реакции в солевой среде. Неполные антитела в этих условиях лишь соединяются с эритроцитами, но не вызывают агглютинации, так что внешне эта реакция ничем не проявляется. Для того, чтобы установить, произошла ли реакция между неполными резус - антителами и эритроцитами, необходимы специальные условия, в частности, добавление различных коллоидов (желатин, полиглюкин) или проведение пробы Кумбса. При всех перечисленных условиях реакция между резус - антителами и эритроцитами, содержащими резус - антиген, в конечном итоге также проявляется в виде агглютинации эритроцитов.
Антигены системы резус имеют белковое происхождение. Одной из характерных черт данной системы является выраженный полиморфизм, что обусловливает наличие многих разновидностей антигенов. В эритроцитах человека выявляется большое количество антигенов и их систем - D, Du, C, c, E, e, Cw, M, N, S, Kell, Kidd, Duffy, Diego и другие. Наибольшее клиническое значение в настоящее время имеют антигены из группы резусов Rh (5 основных) – D, C, c, E, e, а также антигены системы Kell (антигены – К, к, Кu и др.). Антиген D и представляет собой, так называемый, резус-фактор (Rh) . 86% населения Российской Федерации относят к резус-положительным (Rh+). Остальные 14 % населения являются резус-отрицательными (Rh-). Резус-отрицательными считают доноров, кровь которых не содержит ни одного из антигенов – D, C и E. Антиген D имеет разновидности, так называемые, «слабые» варианты, которые составляют группу – Du и встречающиеся с частотой 1%. Доноры, содержащие Du, должны быть отнесены к резус-положительным. Это необходимо учитывать при переливании крови для избежания гемотрансфузионных осложнений.

Обнаружить такие антигены можно, применяя специальные методы.
В основе теста лежит иммунологическая особенность эритроцитов группы 0 - они не несут на себе ни А-, ни В-антигенов. Поэтому любая агглютинация при добавлении к ним сыворотки пациента будет обусловлена присутствием в ней нетипичных антител. Отсутствие агглютинации указывает на их отсутствие.
В ряде случаев к данным антигенам в организме человека начинается выработка антител (аллоиммунных антител). Такое состояние чаще наблюдается при беременности и переливании крови. Во время беременности у резус-отрицательной матери резус-положительного плода может развиться резус-конфликт, заключающийся в образовании антител в организме матери к эритроцитам плода, что способствует разрушению эритроцитов плода. Такой конфликт может приводить к выкидышу или гемолитической анемии плода. Если плод резус-отрицательный у резус-положительной матери, то резус-конфликт не развивается. Наибольший риск возможен при беременности если мать принадлежит к первой группе крови и резус-отрицательна, а отец - первой группы и резус-положительный. В этом случае имеется один шанс из четырех, что ребенок будет резус-положительным.
Любой из выше перечисленных антигенов при попадании в кровь антиген-отрицательной матери (не содержащей различные виды эритроцитарных антигенов) может вызвать появление аутоантител и осложнять течение беременности. Иммуногенность основных антигенов системы-резус убывает в порядке: с- Е-С-е.

Для профилактики резус-конфликта при беременности резус-отрицательные женщины должны находиться на учете в женских консультациях и проходить периодические обследования на появление аллоиммунных антител (чаще определяют антитела к резус-фактору), поскольку риск развития резус конфликта в этой ситуации может составлять до 15%.

ПРИОБРЕТЕННЫЙ ИММУНИТЕТ

Основные особенности адаптивного иммунитета, отличающие его от врожденного иммунитета:

1. адаптивный иммунитет узкоспецифичен, поскольку он направлен против индивидуальных чужеродных молекул - антигенов

2. в адаптивном иммунитете эффекторные клетки не предобразованы, а формируются в процессе иммунного ответа на антиген de novo;

3. в результате адаптивного иммунного ответа формируется иммунологическая память (память о встрече с антигеном), ускоряющая и усиливающая ответ на повторное поступление антигена.

Антигены

Антигены - это биологические тела и молекулы, несущие признаки чужеродной генетической информации и способные вызвать иммунный ответ. Антигены - это не особый класс соединений: ими могут быть белки и некоторые другие макромолекулы (например, полисахариды), в том числе комплексированные с любыми химическими структурами.

Антиген обязательно должен обладать следующими свойствами:

- чужеродностью , т.е. антиген должен быть носителем чужой генетической информации. Чем дальше в эволюционном отношении находится друг от друга индивидуумы, тем большей чужеродностью может обладать данный антиген. Однако, антигены, которые несут одинаковые функции у удаленный в эволюционном отношении видов (гемоглобин) является плохими антигенами, по в результате эволюции в них не произошли значительные преобразования.

- иммуногенность , т.е. антиген должен не просто проникнуть в организм и связаться и рецепторами Ig, но и должен вызвать иммунный ответ. Ряд химических веществ может просто взаимодействовать с поверхностными рецепторами В-лимфоцитов, либо с ТКР, но при этом пролиферации этих клеток не произойдет или же не будет определенного иммунного ответа. Иммуногенность возрастает по мере увеличения «эволюционного расстояния» между донором и реципиентом белка. В основе повышения иммуногенности лежит увеличение различий в первичной структуре белков.

Ряд низкомолекулярных соединений может обладать свойством чужеродности, антигенности, но при этом не обладают иммуногенностью. Эти вещества называется гаптенами. Например, наркотики, гормоны непептидной природы, лекарства являются гаптенами.

- специфичность , т.е. определенный антиген может взаимодействовать с определенным антителом или Т-клеточным рецептором. Различают типовую, групповую, патологическую, видовую и др. специфичности.

- антигенность , подразумевается наличие у индивидуума специфичных к данному антигену растворимых антител или В и Т-клеточных рецепторов.

Антигенами могут быть белки и углеводы. Липиды, нуклеиновые кислоты и другие органические вещества (в некоторых случаях - также неор-

ганические, например, некоторые металлы) эффективны лишь в составе

комплексных соединений (например, в комплексе с белками), определяя

при этом не иммуногенность, а специфичность антигена (т.е. выполняя роль эпитопа). Важнейшее качество, определяющее иммуногенность антигенов, - размер молекулы. С повышением молекулярной массы полимерных молекул

увеличивается их иммуногенность.

Самыми хорошими АГ являются белки. Особенно это касается белков, в состав которых входит большое разнообразие аминокислотных остатков. Гомополимеры, например, коллаген, кератин – плохие АГ.

В АГ различают высокомолекулярную часть (тягач или шлеппер) и антигенные детерменанты, т.е. те участки молекулы, которые несут свойство чужеродности и которые непосредственно узнаются B и Т-клеточными рецепторами или Ig. Эти антигенные детерменанты называются эпитопами . Каждый эпитоп взаимодействует с соответствующим паратопом антител. Различают поверхностные и скрытые эпитопы. У одного и того же АГ может быть много эпитопов. Причем иногда эти эпитопы могут иметь разную специфичность. Эпитоп необязательно представлен аминокислотными остатками находящимися в первичной последовательности рядом. Он может формироваться при образовании третичной структуры белка. Кроме того в структуре антигена различают агретоп - это участок АГ, который взаимодействует в дальнейшем с антигенами МНС.

Различают тимус-зависимые (ТЗА) и тимус-независимые антигены (ТНА). ТЗА должны для полноценного иммунного ответа сначала представлены в иммуногеном виде Т-лимфоцитам. Только в таком виде они могут вызвать полноценный иммунный ответ, заключающийся в образовании антител, либо в цитотоксических реакциях. Т.о. эти АГ должны взаимодействовать с рецепторами классов МНС-1 и МНС-2. Это явление называется рестрикцией антигена по МНС. Большинство антигенов являются тимусзависимыми.

ТНА-антигены, как правило, крупные молекулы (с молекулярной массой порядка 103 кДа). По химической природе это могут быть полисахариды,

ЛПС или белки. Они поливалентны, содержат повторяющиеся эпитопы. Для ответа на эти антигены не требуются их обработка и презентация АПК. Они непосредственно взаимодействуют с В-лимфоцитами. Различают ТН1 и ТН2 антигены. В качестве примераТН-1 антигенов можно привести большинство бактериальных ЛПС, полифлагеллин, полисахарид бордетелл, а также их конъюгаты с гаптенами. Важно отметить, что ТН-1 антигены обладают митогенными свойствами в отношении В-клеток. К ТН-2 антигенам относят полисахаридные антигены (в том числе бактериальные), конъюгаты гаптенов с фиколлом, лева ном, некоторые разновидности ЛПС, некоторые синтетические антигены (например, поливинилпирролидон).

Основной изотип антител, специфичных к тимуснезависимым антиге-

нам, - IgM; при этом переключения изотипа обычно не происходит, отсутст-

вует «созревание аффинитета» и практически не формируется иммунологи-

ческая память и, как следствие, не развивается вторичный иммунный ответ.

Антигены эритроцитов человека

На поверхности различных клеток крови находятся рецепторы, которые могут быть узкоспецифичны и характерны только для данного индивидуума. Что касается эритроцитов, то всю популяцию человека по АГ, находящихся на поверхности эритроцитов можно разделить на 4 группы. Это различие между группами крови людей основано на следующих фактах:

На поверхности эритроцитов группы крови О (I гр) находится определенный гликопротеид (т.н. вещество Н). У людей группы крови А (II) к этому веществу присоединяется N-ацетилглюкозамин. У людей группы крови В (III) к веществу Н присоединяется галактоза. У людей с группой кров АВ (IV) к веществу Н присоединяется и N-ацетилглюкозамин и галактоза. Присоединение сахаров осуществляет спецефические ферменты - гликозилтрансферазы.

Классификация на эти группы обусловлена не только различием в их поверхностном фенотипе (АГ, А,В, О, АВ), но и особенностями генотипа. У людей группа крови О (I) нет генов ответственных за экспрессию гликозилтрансфераз, которые могут привести к переносу на вещество Н N-ацетилглюкозамина или галактозы. У людей с группой крови I и II имеются гены, ответственные за экспрессию соответствующих гликозилтранфераз. У людей с группой крови IV имеются оба гена.

В крови у людей с группой крови А имеются антитела (изогемоглютенины) к антигенам группы крови В . У людей группы крови В , соответственно имеются антитела к антигену А (анти-А или a). У людей группы крови О имеются и анти-a и анти-β. А у людей группы крови АВ их нет.

При переливании крови важно учесть группы крови, поскольку могут случиться реакции, связанные с несовместимостью. Если к данному АГ при переливании в крови реципиента имеются антитела, то могут произойти следующие реакции:

1) так как эти антитела Ig класса М , которые являются поливалентными, они могут взаимодействовать с несколькими эритроцитами одновременно, а на в поверхности одного и того же эритроцита могут сорбироваться антигенсвязывающие участки разных Ig M . В результате этого происходит склеивание эритроцитов (агглютинация). Эти комплексы могут в дальнейшем оседать на поверхности сосудов, вызывая воспаление и активации системы фибринолиза.

2) Ig связавшись с эритроцитами могут активировать систему комплемента с образованием МАК, что приводит к их гемолизу.

Существует другая группа антигенов, которые тоже могут вызвать патологические гемотрансфузионные реакции. Это система называется резус. В популяции человека существует 2 группы «+» и «–» резус. Это обусловлено наличием на поверхности у одной группы резус-антигена Д (или Rh) у другой группы этого антигена нет, но зато есть антитела к антигену Д (анти-Д).

Антиген Д кодируется соответствующим геном.

Особое внимание заслуживает система Rh во время беременности поскольку. Если мать RhД-, а плод RhД+, то эритроциты плода попадают в кровь матери обычно во время родов и повреждения родовых путей. Это стимулирует образование антител анти-Rh класса IgG в послеродовой период. При последующей беременности IgG-антитела проходят через плаценту в кровь плода (антитела IgM не проникают через плаценту). Если плод опять окажется RhД+, IgG –антитела матери вызывают разрушение его эритроцитов. Поэтому введение Ig-антирезусных (анти-Д_ во время родовой деятельности при первой беременности может препятствовать сенсибилизации иммунной системы матери эритроцитами плода, так как эти Ig будут лизировать эритроциты плода посредством запуска системы комплемента.


©2015-2019 сайт
Все права принадлежать их авторам. Данный сайт не претендует на авторства, а предоставляет бесплатное использование.
Дата создания страницы: 2016-04-11

Среди антигенных систем, после системы А, В, 0, наиболее частой причиной посттрансфузионных осложнений как при повторных переливаниях крови, так и у женщин, сенсибилизированных в процессе беременности, является система Резус, включающая 51 эритроцитарный антиген. Гены, кодирующие антигены этой системы, открыли в 1939 г. П. Левин и Р. Стетсон, антигены экспрессируются также на эритроцитах обезьян Macaca rhesus, антитела к которым агглютинировали эритроциты человека. Именно поэтому их назвали резус-антигенами (Rh) в 1940 г. К. Ландштейнер и А. Винер, работавшие с этими обезьянами при изучении эритроцитарных изоантигенов. Основные отличия системы Резус от системы А, В, 0 заключаются в том, что антигены А, В, 0 определяются в биологических жидкостях, тогда как антигены Rh в таких жидкостях отсутствуют. Антитела против изоантигенов системы А, В, 0 являются естественными, тогда как антирезусные антитела образуются во время беременности, при попадании резус-положительных эритроцитов плода в организм резус-отрицательной самки. Антирезусные антитела являются иммунными.
После антигенов систем А, В, 0 и Резус наибольшую клиническую значимость имеют антигены систем Келл, Даффи, MNS и др., однако антигенность компонентов этих систем по сравнению с антигенами систем A, В, 0 и Резус существенно меньшая.

Природа антигенов системы резус


Среди известных более 50 антигенов системы Rhesus (Rh) наиболее иммуногенными, а следовательно, и имеющими наибольшее клиническое значение, являются антигены D, С, Е, с и е (классификация Е. Фишера и Р. Рейса), контролируемые двумя высокогомологичными тесно сцепленными локусами генов 1-й хромосомы - RhD (экспрессии антигена D) и RhCE (экспрессия антигенов Ce и Ее). Среди этих антигенов наибольшей иммуногенностью характеризуется антиген D, поэтому он был назван антигеном Rh, его обозначение используется для обозначения Rh-положительных лиц. Среди жителей Европы он выявляется на эритроцитах 85% людей, 15% лиц являются Rh-отрицательными, Антиген d на эритроцитах Rh-положительных лиц не определяется, но обнаруживается на эритроцитах Rh-негативных особей. В связи с этим антиген d фактически является маркером Rh-негативных лиц. Иммуногенность других антигенов системы Резус убывает в ряду D>C>E>c>e. Экспрессия антигена С обнаруживается на эритроцитах 70% лиц, С - на эритроцитах 30% лиц, с - 85%, е - 97%. Помимо эритроцитов антигены системы Резус обнаружены в клетках фиксированных тканей человека - печени, почек, селезенки, надпочечников, слюнных желез, поджелудочной железы, мышцы сердца, пищевода, желудка, раковых опухолей человека.

Антитела к антигенам системы резус и эритобластоз новорожденных


Антитела к антигенам Rh, как и к антигенам системы А, В, 0, образуются при переливаниях крови, несовместимой по Rh-антигенам, а также при беременности в результате иммунизации Rh-негативной матери эритроцитами Rh-положительного плода. Образование таких антител возможно и при пересадках аллогенных тканей. Однако поскольку при пересадках тканей наибольшую роль в судьбе аллотрансплантата играют антигены главного комплекса гистосовместимости, а переливания Rh-несовместимой крови в клинической практике фактически исключены, наибольшую клиническую значимость имеет несовместимость матери и плода по антигенам системы Резус. Такая ситуация имеет место в тех случаях, когда мать и отец характеризуются, соответственно, как Rh- и Rh+. Плод, наследуя Rh-антигены отца, несовместим по Rh-антигенам с матерью, не имеющей таких антигенов. В результате эритроциты плода или антиген разрушенных эритроцитов, попадая в кровь матери, например вследствие родовой травмы, индуцируют образование анти-Rh-антител. Как отмечалось выше, эти антитела относятся к классу IgG, способны проникать через плаценту. При первой беременности сенсибилизация матери Rh-антигенами плода практически незначима для немедленной массивной продукции анти-Rh-антител. Однако при повторных беременностях против антигенов Rh продуцируется большое количество антител, которые проникают через плаценту, транспортируются в кровь плода и атакуют его зрелые эритроциты. Вследствие их гемолиза кровь плода остается насыщенной незрелыми эритроцитами - эритробластами. В результате происходящих процессов развивается общий отек плода, желтуха, анемия. В тяжелых случаях возможен летальный исход или рождение ребенка с симптомами тяжелой гемолитической болезни (эритробластоза).
Вместе с тем несмотря на то, что достаточно большое количество женщин являются Rh-отрицательными, возможность указанного исхода не очень велика, по имеющимся данным около 10% от теоретически вероятного. Это объясняется несколькими причинами. Во- первых, попадание эритроцитов плода в кровь матери в количествах, достаточных для образования антител к антигенам Rh, происходит не так уж часто. Во-вторых, вследствие генетических причин (отсутствие соответствующего гена или наличие слабого гена иммунного ответа), не все матери являются сильно реагирующими на данный конкретный антиген и могут относиться к слабо- или к нереагирующему на антигены Rh генотипу. В-третьих, если отец гетерозиготен по антигену Rh (т.е. наследовал резус-отрицательный ген одного из своих родителей), то дети являются резус-положительными лишь в 50% случаев. В-четвертых, примерно в 20% случаев предсуществующие антитела матери, например группы 0 (I), атакуют Rh+ эритроциты плода и лизируют их, если они относятся к группам А, В или AB системы А, В, 0. В этом случае устраняются эритроциты плода, способные индуцировать образование антител к антигенам Rh. Наконец, немаловажным обстоятельством является то, что первая беременность очень редко приводит к болезни плода. Чаще всего осложнения наступают при второй, а иногда и при третьей беременности.
Следует отметить, что гемолитическая болезнь новорожденных - не единственный пример нарушения нормального процесса беременности вследствие сенсибилизации матери клетками плода. Е.А. Зотиков приводит примеры нейтропении (врожденная нейтропения или агранулоцитоз) и транзиторной тромбоцитопении новорожденных, индуцированных описанными выше механизмами. В первом случае заболевание индуцировалось в результате сенсибилизации матери лейкоцитами плода. Образованные антилейкоцитарные антитела при повторных беременностях проходят через плаценту, оказывают цитопатогенное действие на нейтрофилы крови плода и подавляют кроветворную функцию костного мозга. Другие антитела матери реагировали с антигенами гистосовместимости плода, экспрессируемыми на всех клетках белой крови - нейтрофилах, моноцитах, тромбоцитах, лимфоцитах, а также на клетках всех органов и тканей. Нейтропения новорожденных характеризовалась транзиторным характером с частыми проявлениями инфекционных заболеваний - флегмонами, гастроэнтеритами, бронхопневмониями и др. Во втором случае заболевание новорожденных было следствием сенсибилизации матери во время беременности антигенами плода, индуцировавшими образование как лимфоцитотоксических, так и антитромбоцитарных антител, поражающих форменные элементы крови плода, в первую очередь тромбоцитов. Наконец, как отмечалось выше, гемолитическая болезнь новорожденных может быть следствием несовместимости матери и плода но антигенам системы А, В, 0.

Диагностика и профилактика гемолитической болезни


Для определения уровня антител после родов и во время последующей беременности ставят серологическую реакцию с использованием сыворотки Rh-негативной матери и эритроцитов Rh-позитивного плода. Взаимодействие антиген-антитело в титре 1:16 считается диагностически значимым.
Антитела к антигенам Rh характеризуют двумя типами - полными и неполными. Полные антитела эффективно агглютинируют или лизируют эритроциты Rh-позитивных лиц. Такие антитела относятся к классу IgM, выявляются у 50% матерей, родивших детей с эритробластозом. У остальных антитела прикрепляются к поверхности чувствительных к ним эритроцитов и блокируют действие полных антител. По другим данным, в 53% сывороток матерей обнаруживаются полные антитела, в 24% - неполные и в 15,8% - смесь обоих типов антител. Считают, что неполные антитела характеризуются относительно низким сродством к антигенной детерминанте, относятся к классу IgG, при гемотрансфузиях имеют большую значимость по сравнению с полными антителами. Неполные антитела определяют с помощью метода Кумбса, используя антисыворотку к иммуноглобулинам класса IgG. В этом случае антисывороточ-ные антитела будут взаимодействовать с неполными антителами, связанными с поверхностью Rh-позитивных эритроцитов. Антирезусные антитела, помимо сыворотки, могут определяться в небольших количествах в молоке рожениц.
Для профилактики гемолитической болезни новорожденных матери непосредственно после рождения первого ребенка (обычно в первые 2 суток) вводят внутривенно 150-300 мкг препарата человеческих иммуноглобулинов класса IgG против Rh (D) антигенов. Введение антител сопровождается разрушением и выведением из кровотока матери эритроцитов плода, вследствие чего антитела против антигенов системы Резус не образуются, и вторая беременность протекает без осложнений. По свидетельству Р.B. Петрова, гемолитическая болезнь новорожденных - это болезнь, единственный метод диагностики которой иммунологический, так же, как и эффективный метод предупреждения которой тоже иммунологический. Это болезнь, искорененная иммунологией.

Широко распространены в природе гетерофиль­ные антигены, отличающиеся от антигенов человека. Они встречаются в клетках некоторых животных, например в эритроцитах барана, обезьяны макаки-резус. В крови других животных, например у кролика их нет. К гетеро­фильным («чужим») антигенам относятся некоторые ле­карственные вещества (сульфаниламиды, антибиотики) и вирусы, которые, фиксируясь на поверхности эритроцита, вызывают выработку антител.

Антигены, имеющиеся только у человека, называются видовыми или неспецифическими . Они есть у всех без исключения людей, т. е. присущи человечеству как виду.

Специфические антигены встречаются лишь у ограниченного числа людей. К ним относятся групповые антигены.

В 1900 г. Ландштейнер установил, что при смешении эритроцитов одного человека с сывороткой другого часто происходит агглютинация эритроцитов. Производя перек­рестные реакции между эритроцитами и сывороткой раз­личных людей, он обнаружил, что одни эритроциты агглютинируются некоторыми сыворотками, а другие нет. Это наблюдение привело к открытию специфических антигенов эритроцитов, обозначенных им буквами латин­ского алфавита А и В. В зависимости от наличия или отсутствия этих антигенов на эритроцитах кровь всех людей делится на четыре группы.

Антигены эритроцитов носят название агглютино­генов , так как они способны агглютинироваться (скле­иваться) с антителами - агглютининами , находящими­ся в сыворотке.

Антигены А и В по химическому составу являются мукополисахаридами. Они содержатся не только в эритро­цитах, но и почти во всех тканях и секретах организма.

Агглютиноген А обладает большой антигенной силой: с антителами анти-А он дает резко выраженную реакцию агглютинации. Он неоднороден по своему составу. Разно­видности антигена А-А 2 , Аз, А 4 - имеют более слабые антигенные свойства.

Агглютиноген В менее сложен, чем агглютиноген А, и способность к агглютинации сыворотками анти-В у него менее выражена.

При дальнейших исследованиях были открыты и дру­гие специфические антигены-М, N, Fу и др., антигенная активность которых невелика.

В 1940 г. Ландштейнером и Винером был открыт еще один антиген эритроцитов, который был назван резус-антигеном и обозначен Rh. Он получил свое наименование от названия обезьян macacus Rhesus. Эритроцитами этих обезьян иммунизировали кроликов, после чего сыворотка крови этих кроликов приобретала способность агглютини­ровать эритроциты макак. Далее оказалось, что эта сыворотка вызывает склеивание не только эритроцитов обезьян, но и большинства людей. Таким образом, был выявлен новый антиген. Резус-антиген содержится в крови 85% людей. Присутствие его в крови обозначают как Rh+ (резус-положительная кровь). Кровь 15% людей этого антигена не содержит. Такая кровь обозначается как Rh- (резус-отрицательная).

Резус-антиген не однороден. Наиболее часто встреча­ется D-антиген, реже С, Е и другие антигены системы резус.

Антигенные свойства крови передаются по наследству.

§ 2. Антиэритроцитарные антитела

Антигены эритроцитов человека открыты с помощью их антагонистов - соответствующих антител. Антитела - это сывороточные белки глобулиновой природы, которые обладают способностью образовывать комплексы с соот­ветствующими антигенами.

Общие свойства антител.

1. Специфичность действия. Антитела фиксируются только на соответствующих анти­генах. Они могут быть гетеро -, изо- и аутоантителами. Гетероантитела активны по отношению к эритроцитам животных разных видов. Изоантитела (групповые) дей­ствуют на эритроциты некоторых людей, содержащих специфические групповые антигены А и В. Аутоантитела активны по отношению к собственным антигенам че­ловека.

2. Температурный оптимум. Определенные антитела проявляют свое действие наилучшим образом при различ­ных температурах. Одни из них действуют при низкой температуре (ниже 15° С) - холодовые антитела, другие - при температуре тела - тепловые антитела.

3. Оптимум рН среды. Для действия антител необходи­ма определенная реакция среды.

4. Титр антител. Титр - это наибольшее разведение сыворотки, содержащей антитела, при котором еще прояв­ляется их действие.

5. Характер появления. Одна часть антител содержится в плазме человека вне зависимости от контакта с соответствующим антигеном (естественные антитела), другая - появляется в результате воздействия антигена (иммунные антитела). Аутоиммунные антитела воз­никают при таких изменениях в структуре антигенов человека, которые вызывают срыв существующей и орга­низме устойчивости к собственным антигенам.

6. Характер действия. Различают, агглютинины, гемолизины, опсонины и преципитины. Агглютинины вы­зывают склеивание эритроцитов, гемолизины способ­ствуют лизису эритроцитов, опсонины участвуют в фагоцитозе эритроцитов лейкоцитами, преципитины вызывают реакцию осаждения из раствора комплекса антиген - антитело. Иногда антитела могут нести несколь­ко функций.

7. Серологические свойства. Различают полные и не­полные антитела. Полные антитела могут путем обыч­ного контакта вызвать агглютинацию эритроцитов, содер­жащих соответствующий антиген. Эта реакция происходит в любой среде - солевой или коллоидной. К таким антите­лам относятся агглютинины анти-А и анти-В. Полный агглютинин можно представить себе как двухвалентную молекулу, оба конца (или валентности) которой способны реагировать как в солевой, так и в альбуминовой среде.

Неполные антитела в солевой среде не могут вы­звать непосредственную агглютинацию. Они вызывают ее лишь в коллоидной среде (например, в желатине или альбумине). Неполные агглютинины встречаются в сыво­ротке людей, имеющих контакт с антигенами, которых эти лица лишены. В результате этого контакта вырабаты­ваются антитела. Неполные антитела могут появляться в сыворотке и на собственных эритроцитах при аутоиммун­ных гемолитических анемиях.

Агглютинины -наиболее часто встречающаяся разно­видность антиэритроцитарных антител. В плазме челове­ка всегда содержатся естественные, полные, холодовые изоантитела к агглютиногенам А и В. Агглютинин анти-А чаще обозначается буквой греческого алфавита a, а агглютинин анти-В-буквой b. Изоантитела характеризу­ются специфичностью действия по отношению к одному из групповых антигенов. Агглютинины дают реакцию агглютинации с агглютиногеном А, агглютинины β - с агглютиногеном В. Такая реакция носит название реакции изогемагглютинации.

К антигенам М, N, Fу и др. естественных антител в крови здорового человека нет. При воздействии этих антигенов на кровь, эритроциты которой их не содержат, вырабатываются иммунные антитела.

При попадании антигена резус в кровь резус-отрицательных людей, в ней появляются резус-антитела. Это также иммунные антитела. По серологическим приз­накам различают полные и неполные резус-агглютинины. Молекулы полных агглютининов большего размера, чем молекулы неполных. Последние выявляются реакцией в коллоидной среде.

Группы крови

На основании реакции изогемагглютинации определяют групповую принадлежность крови людей. В зависимости от наличия или отсутствия агглютиногенов А и В и агглютининов a и b, от их комбинаций в крови людей все человечество разделяют на 4 группы.

В крови человека никогда не встречаются одноимен­ные агглютиногены и агглютинины.

У людей, имеющих группу крови I, эритроциты не содержат агглютиногенов, а в сыворотке имеются оба агглютинина a и b. Группа крови I обозначается как 0(1).

В эритроцитах людей с группой крови II находится агглютиноген А, а в их сыворотке - агглютинин b.

Принятое обозначение - А (П).

Эритроциты группы крови III несут агглютиноген В, в сыворотке крови этой группы содержится агглютинин a.

Принятое обозначение – В (Ш).

На поверхности эритроцитов людей с группой крови IV находятся оба агглютиногена А и В, но в их сыворотке нет агглютининов. Обозначается группа крови IV как АВ(1У).

Схематически групповую принадлежность людей по системе АВО можно представить следующим образом:

Группа крови Агглютиноген Агглютинины Обозначение

III В a В (Ш)

IV АВ 0 АВ(1У)

Распределение людей по группам крови неравномерно. Наиболее часто встречаются люди с группой 0(1)-33,5%. Несколько реже - с группой А (П) - 27,5%. Группа В (Ш) составляет 21%, а АВ(1У)-8%.

Клиническое значение

В основе реакции гемагглютинации лежит взаимодей­ствие между антигенами эритроцитов и соответствующими антителами сыворотки. Эта реакция имеет большое значе­ние в практике переливания крови.

Переливание крови как терапевтическое средство широко применяется в клинике. Однако при этом возможен целый ряд осложнений, проявляющихся в виде гемолитических реакций. Эти опасные осложнения могут привести к смерти больного вследствие массивного разрушения эритроцитов донора антителами реципиента - человека, которому переливают кровь.

Определение групп крови и резус-фактора делает переливание крови безопасным. Существуют определен­ные правила, которых необходимо придерживаться при переливании крови: эритроциты донора не должны содер­жать антигенов, соответствующих антителам реципиента, т. е. А a, В и b . При этом агглютинины донора можно не учитывать. Если титр их невысок, они разводятся плазмой крови реципиента.

Следовательно, кровь группы 0(I), не содержащую агглютиногенов, можно переливать людям с любой груп­пой крови. Лица, имеющие группу крови 0(I), считаются «универсальными донорами». Кровь группы А(II) перели­вается реципиентам группы А(II) и группы АВ(IУ), не содержащей агглютининов. По той же причине кровь группы В(III) может быть перелита лицам с группой В(III) и АВ(IУ).

Из чего следует, что людям с группой крови АВ(1У) может быть перелита кровь людей любой группы. Лица группы АВ(IУ) названы поэтому «универ­сальными реципиентами».

При переливании незначительных количество крови этой схемой можно пользоваться. Однако в современной хирургической практике, когда переливаются большие количества крови, замена трети или половины массы крови групп А(II), В(Ш) или АВ(1У) кровью группы 0(1) может привести к разрушению оставшегося количества крови реципиента антителами донорской крови. Поэтому в настоящее время рекомендуется переливать только одногруппную кровь.

Переливание крови, несовместимой по резус-фактору, также, приводит к серьезным осложнениям. При однок­ратном переливании резус-положительной крови человеку резус-отрицательному в его организме начинается выра­ботка антител. Анти-резус агглютинины образуются не сразу, поэтому реакция на переливание несовместимой по резус-фактору крови бывает замедленной. При повторных переливаниях резус-отрицательному реципиенту резус-положительной крови титр антител возрастает, что приво­дит к массивному гемолизу эритроцитов реципиента.

Серологические реакции также играют значительную роль в выявлении механизма возникновения изоиммунной гемолитической анемии новорожденных.

В случае беременности резус-отрицательной женщины, плод, унаследовавший резус-антиген от отца, вызывает в крови матери выработку иммунных агглютининов анти­резус. При повторной беременности титр антител нараста­ет. Неполные иммунные антитела способны проникать через плаценту. Они оседают на эритроцитах плода, вызывая их агглютинацию и последующий гемолиз. Это может привести к гемолитической анемии новорожденного или, в тяжелых случаях, к внутриутробной гибели плода.

Вопросы для повторения

1. Что представляют собой антигены эритроцитов?

2. Какие разновидности антигенов находятся на поверхности эритроци­тов?

3. Каковы химические и антигенные свойства агглютиногенов А и В?

4. Каким образом был открыт резус-антиген?

5. Какая кровь называется резус-положительной и какая, резус-отрицательной?

6. Что такое антитело?

7. Каковы общие свойства антител?

8. Что подразумевается под специфичностью и характером действия антител, характером их появления?

9. Каковы серологические свойства антител?

10. Каковы по характеру появления агглютинины a и b ?

11. Каковы свойства резус-антител по характеру появления и серологи­ческим признакам?

12. Что положено в основу деления крови на группы?

13. Каково клиническое значение определения групп крови?

14. Каково клиническое значение определения резус-фактора?

Метод агглютинации в геле для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител

Введение

Гелевая технология в микропробирках (ГТМ) была предложена Y. Lapierre в 1989 г. Метод основан на агглютинации эритроцитов в агаровом геле "сефадекс", помещенном в микропробирки. Обычно система представляет собой пластиковые карты, содержащие микропробирки, заполненные гелем (патент DiaMed AG, Швейцария). Иммуногематологические исследования, основанные на реакции гемагглютинации, обычно проводятся в жидкофазных системах.

Одним из наиболее важных условий получения корректных данных реакции агглютинации является оценка результата. Слабая реакция может быть неверно интерпретирована, особенно неопытным персоналом. Ложные слабые или отрицательные результаты непрямого антиглобулинового теста могут иметь место за счет нейтрализации антиглобулинового реагента следами сыворотки вследствие недостаточно эффективного отмывания эритроцитов. Неадекватное перемешивание эритроцитов и элюция слабофиксированных антител в процессе отмывания могут стать причиной ошибок при проведении непрямого антиглобулинового теста.

Методика агглютинации в геле была разработана с целью стандартизации реакций гемагглютинации и получения достоверных результатов. Гелевая технология предусматривает разделение эритроцитов при центрифугировании, при этом неагглютинированные эритроциты проходят через гель и оседают на дне пробирок (отрицательный результат), в то время как агглютинированные задерживаются на поверхности или в толще геля (положительный результат). Центрифугирование в геле может быть конечной фазой любых серологических исследований, основанных на реакции гемагглютинации, кроме методов, требующих диспергирования для оценки результата.

Диапазон выполняемых тестов включает в себя определение фенотипа эритроцитов (включая слабые варианты антигенов), антиглобулиновый тест, скрининг и идентификацию антител, тесты на совместимость и некоторые другие.

Принцип гелевого теста

Забуференный декстрановый гель Sephadex ТМ G 100 superline может быть как нейтральным, так и содержащим специфические антисыворотки или антиглобулиновый реагент на гелевом матриксе. На гель наносятся эритроциты или смесь эритроцитов и сыворотки. Клетки всегда вносятся перед сыворотками - в отличие от стандартных серологических методик - с тем, чтобы тестируемые сыворотки не контактировали с гелем, что особенно важно при проведении антиглобулинового теста. После инкубации следует центрифугирование в строго определенном режиме. Если условия центрифугирования не выполняются (центрифугирование недостаточно длительное или слишком мягкое) могут иметь место ложноположительные результаты. Ложноотрицательные результаты также могут иметь место при нарушении условий (форсировании) центрифугирования. Использование автоматической ID-центрифуги (ДиаМед) устраняет эти проблемы. Для проведения тестов обычно используются три вида геля:

  1. нейтральный, не содержащий специфических антител (применяется для поиска и идентификации антител солевым, и ферментным методами, холодовой стадии пробы на совместимость крови донора и реципиента);
  2. специфический, содержащий антитела (моноклональные или поликлональные) к антигенам эритроцитов крови человека (применяется для типирования антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл и т.д.)
  3. антиглобулиновый, содержащий антитела (полиспецифические или моноспецифические) к иммуноглобулинам человека и компонентам системы комплемента (применяется для прямого и непрямого антиглобулинового теста (реакции Кумбса) при поиске и идентификации ауто- и аллоиммунных антител, пробе на совместимость крови донора и реципиента).

Исследуемая кровь добавляется в верхнюю часть микропробирок диагностических карт, и при центрифугировании осуществляется разделение агглютинированных и неагглютинированных эритроцитов следующим образом: неагглютинированные эритроциты имеют размер, сравнимый с размером частиц геля и свободно проходят сквозь них под действием центробежной силы, формируя на дне микропробирки компактный осадок красного цвета - отрицательный результат; агглютинированные эритроциты ввиду больших размеров задерживаются на поверхности геля или в его толще - положительный результат.

Фиксированная агглютинация в геле позволяет легко оценивать результат реакции, а наличие контрольной микропробирки в диагностической карте подтверждает достоверность полученных данных.

В зависимости от силы реакции агглютинации в гелевой среде принята следующая оценка полученных результатов:

  • сильноположительный (++++) - образовавшиеся агглютинаты эритроцитов задержались на поверхности геля;
  • положительный (+++) - агглютинаты располагаются в верхней трети столбика геля;
  • слабоположительный (++) - агглютинаты фиксированы в верхних двух третях геля;
  • очень слабоположительный (+) - агглютинаты располагаются в нижней трети геля;
  • отрицательный (-) - эритроциты формируют на дне микропробирки компактный осадок.

Оборудование и реактивы

  • ID-карты для определения антигенов эритроцитов и антиэритроцитарных антител;
  • ID-центрифуга для центрифугирования карт;
  • термостат на +37°С;
  • штатив для пробирок и карт;
  • пробирки вместимостью 5 и 10 мл;
  • пипетки полуавтоматические одноканальные (10, 25, 50 мкл);
  • перчатки резиновые хирургические;
  • раствор для разведения 1 (раствор бромелина);
  • раствор для разведения 2 (раствор низкой ионной силы - LISS, РНИС);
  • 0,9% раствор хлорида натрия;
  • стандартные типированные эритроциты человека для выявления антител и проведения перекрестной реакции.

Характеристика идентификационных карт

Идентификационные карты (ID-карты) Диа-Мед представляют собой пластиковые карточки, в которые встроено по шесть микропробирок. В пяти пробирках содержится смесь геля и антисывороток. Каждая карточка имеет шестую контрольную пробирку, содержащую нейтральный гель без антител (сtl). Маркировка пробирок в ID-карте осуществляется по выявляемым антигенам, например: А-В-АВ-D-СDЕ-сtl или С-с-Е-е-К-ctl. Идентификационные карты для выявления антител к антигенам эритроцитов имеют некоторые отличия, например, карты "Coombs / Enzyme Test": в трех пробирках, расположенных слева, содержится гель, содержащий антитела к глобулинам человека (моноспецифические анти-IgD или полиспецифические - к иммуноглобулинам различных классов) - реакция Кумбса. В следующих трех пробирках содержится только нейтральный гель, предназначенный для выявления антител к антигенам эритроцитов в солевой среде.

Общие правила использования идентификационных карт

  1. Идентификационные карты должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 18-25°С. Срок годности указан в паспортной части каждой карты и на упаковочных коробках.
  2. Растворы для приготовления суспензии эритроцитов, а также стандартные сыворотки и стандартные ID-эритроциты, использующиеся в отдельных исследованиях, должны храниться в сухом, защищенном от света месте при температуре 2-8°С. Срок годности указан на этикетке каждого флакона и упаковочной коробке.
  3. Во избежание получения ложных результатов исследований, запрещается использование любых реагентов и карт с истекшими сроками годности, а также высохших, содержащих пузырьки газа или при повреждении оболочки.
  4. Заготовка крови осуществляется с применением современных флеботомических методик, а также пригодна артериальная, капиллярная и пуповинная (без отмывания) кровь. Для исследований пригодны как образцы цельной крови (взятые в чистую, сухую пробирку), так и образцы крови, взятые на консервантах и стабилизаторах.

Типирование антигенов эритроцитов

ID-карты ДиаМед предназначены для одновременного определения группы крови по системе АВО и резус-принадлежности эритроцитов доноров и реципиентов (включая их слабые варианты антигенов), а также для типирования других антигенов эритроцитов. ID-карты ДиаМед можно использовать взамен или параллельно с изогемагглютинирующими сыворотками, реагентами анти-D, анти-DСЕ, цоликлонами анти-А, анти-В, анти-D и анти-D Супер.

  • [показать] .

    Начальный этап выполняется по-разному, в зависимости от вида используемых ID-карт, содержащих поликлональные (см. ниже п.1а) или моноклональные (см. п. 16) антитела:

    1а) Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения ICID-карты, содержащие поликлональные антитела) для чего:

    • выдержать Раствор для разведения 1 до достижения им комнатной температуры;
    • приготовить 5% суспензию исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 1, поместив в пробирку 0,5 мл Раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы;
    • аккуратно смешать и инкубировать 10 мин при комнатной температуре;
    • использовать не позднее 15 мин после инкубации.

    16) Приготовить взвесь исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 2 (ID-карты, содержащие моноклинальные антитела) для чего:

    • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения им комнатной температуры;
    • промаркировать чистые пробирки;
    • приготовить 5% суспензию исследуемых эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 0,5 мл Раствора для разведения 1 и 50 мкл исследуемой цельной крови или 25 мкл эритроцитной массы.
  • Дальнейшие действия [показать] .
    1. Промаркировать ID-карту (N исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента).
    2. Снять защитную фольгу с пробирок ID-карты.
    3. В каждую пробирку ID-карты внести по 10 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с п.1а, или по 50 мкл исследуемых эритроцитов, приготовленных в соответствии с п.16.
    4. Установить ID-карты в ротор ID-центрифуги (с обязательным уравновешиванием другими ID-картами, возможно, неиспользованными).
    5. Центрифугировать ID-карты (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически).
    6. Оценить результат исследования: Результат в контрольной микропробирке - "ctl" - должен быть всегда отрицательным. Положительная реакция в "контроле" может быть вызвана присутствием аутоантител и неспецифическими плазменными белками. Если "контроль" положителен - определение недостоверно, его необходимо повторить после однократного отмывания образца эритроцитов 0,9% раствором хлорида натрия или Раствором для разведения 2.
    7. Результаты определения каждого антигена внести в соответствующую графу ID-карты (на белом поле внизу под каждым антигеном).
    8. Идентифицировать результат по следующей схеме (табл. 18.7-18.9)
    Таблица 18.7. Результаты исследования антигенов группы крови АВО и резус-принадлежности в ID-карте АВО/Rh
    Выявляемые антигены Заключение
    А В АВ D СDЕ
    + + + + + АВ Rh+
    + + + - - АВ Rh-
    + - + + + А Rh+
    + - + - - А Rh-
    - + + + + В Rh+
    - + + - - В Rh-
    - - - + + 0 Rh+
    - - - - - 0 Rh-
    Примечание: Специфичность исследования подтверждается по отрицательному результату в пробирке с контролем ID-карты.
    Таблица 18.8 Определение антигенов эритроцитов системы АВО
    Группа крови
    анти-А анти-В анти-АВ
    0(1) - - -
    А1(II) ++++ - ++++
    А2(II) ++++ - ++++
    А3(II) ++/+++ - ++/++++
    А x (II)* -/++ - +/++
    В(II) - ++++ ++++
    В3(III) - +/+++ +/+++
    В x (III)* - -/++ -/++
    А1В(IV) ++++ ++++ ++++
    А2В(IV) +++/++++ ++++ ++++
    Примечание : * - определение очень слабых вариантов антигенов А и В требует дальнейших исследований.
    Таблица 18.9 Определение резус-принадлежности (D, СDЕ)
    Резус-принадлежность Результаты исследования с сыворотками
    Анти-D Анти-СDЕ
    D-положительная ++++ ++++
    D-отрицательная - -
    D-отрицательная, С Е- положительная* -
    Слабоположительная (D u) от ± до +++ от +++ до ++++
    Примечание : * - Положительная реакция с сывороткой анти-СDЕ при отрицательной реакции с сывороткой анти-D свидетельствует о наличии антигенов С, Е и требует дальнейшего типирования с использованием ID-карт: С-с-Е-е-К-сtl или С-С w -с-Е-е-К

Используемые ID-карты

При определении групп крови и резус-принадлежности применяют поликлональные (табл. 18.10 [показать] ) и моноклональные (табл. 18.11 [показать] ) реагенты. Наиболее частое применение на практике вследствие экономической целесообразности находят моноклональные сыворотки.

По современной классификации лица с ослабленным вариантом антигена D, способные вырабатывать анти-D-антитела, подразделяются на семь категорий. Наибольшую частоту встречаемости и практическое значение имеет категория VI, эритроциты которой несут только эпитоп Z антигена D. Лица категории VI (резус-отрицательные реципиенты, но резус-положительные доноры!) могут вырабатывать антитела к неизмененному D и частичному D всех остальных категорий. Для подтверждения группы крови используют различные ID-карты: D(IV -) - для реципиентов, D(IV +) - для доноров.

Определение группы крови АВО и резус-принадлежности проводят путем идентификации специфических антигенов и антител (двойная или перекрестная реакция) (табл. 18.12 [показать] ).

Для углубленного обследования используют другие карты (табл. 18.13-18.14 [показать] ).

Таблица 18.14. ID-карты для типирования других антигенов эритроцитов
ID-карты Конфигурация
Anti-D(human) 6xD
DiaClon anti-Dvi pos 6xD(vi+)
DiaClon anti-Dvi neg 6xD(vi-)
Anti-C w 6xC w
ID-anti-D for D weak confirmation Vial (флакон)
Anti-K(KELl) 6xK(KELl)
DiaClon anti-K(KELl) 6xK(KELl)
Anti-k(KEL2) 6xk(KEL2)
Anti-M 6xM
Anti-N 6xN
Anti-P 1 6xP 1
Anti-Le a 6xLe a
Anti-Le b 6xLe b
Anti-Jk a 6xJk a
Anti-Jk b 6xJk b
Anti-Kp a 6xKp a
Anti-Kp b 6xKp b
Anti-Lu a 6xLu a
Anti-Lu b 6xLu b

Выявление антиэритроцитарных антител

Принцип метода

Исследуемые сыворотки и стандартные эритроциты для выявления антител добавляются в верхнюю часть микропробирок. После инкубации и центрифугирования агглютинированные эритроциты остаются в верхней части пробирки, так как не проходят через гель из-за большого размера агглютинатов (положительный результат). При отсутствии антител к антигенам тест-эритроцитов агглютинаты не образуются. Неагглютинированные эритроциты легко проходят через гель и оседают на дне пробирки (отрицательный результат). Характер агглютинации при выявлении антител к эритроцитам зависит от титра антител, их активность и оценивается от ++++ до +.

  • Алгоритм проведения исследований [показать] .

    Типированные эритроциты перед исследованием необходимо предварительно дважды отмыть от консерванта 0,9% раствором хлорида натрия, а затем выполнить следующие действия:

    • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения комнатной температуры;
    • промаркировать пробирки;
    • приготовить 0,8% взвесь типированных эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл Раствора для разведения 2 и 10 мкл крови;
    • снять защитную фольгу с ID-карты;
    • промаркировать ID-карту (номер исследуемого образца сыворотки или Ф.И.О. пациента);
    • добавить по 50 мкл стандартных эритроцитов в микропробирки;
    • добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы исследуемого образца в каждую микропробирку;
    • инкубировать 15 мин при температуре +37"С;
    • центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически).

    Примечание: стандартные эритроциты панели ID-DiaCell I-II-III и ID-DiaCell I-Ii-III P фирмы DiaMed готовы к применению без предварительного отмывания и обработки Раствором для разведения 2.

  • Интерпретация результатов [показать] .

    Положительная реакция означает наличие в исследуемом образце иммунных антител.

    Если имеет место положительная реакция со всеми эритроцитами панели ID-DiaCell, рекомендуется выполнять аутоконтроль для исключения аутоантител в исследуемом образце.

    Если с одним или более видом эритроцитов панели ID-DiaCell реакция остается отрицательной, специфичность антител может быть установлена с помощью сопроводительного листа - таблицы антигенных профилей, прилагаемой ко всем упаковкам ID-DiaCell. При этом необходимо убедится в том, что номера панели ID-DiaCell1 и сопроводительного листа совпадают.

    Если данная панель не позволяет установить специфичность антител, рекомендуется продолжить идентификацию, используя расширенную панель эритроцитов ID-DiaРanel и/или ID-DiaРanel Р (в зависимости от первоначально использованной методики).

Скрининг и идентификация антител

Скрининг антител выполняется как в нейтральном геле, так и в геле, содержащем антиглобулиновый реагент (табл. 18.15-18.16 [показать] ). В первом случае для исследования используются обработанные ферментом эритроциты, во втором - суспензия эритроцитов в растворе низкой ионной силы. Скрининг и идентификация антител производятся с помощью стандартной панели эритроцитов. При оценке эффективности гелевого теста для скрининга и идентификации антител была установлена его более высокая чувствительность по сравнению с традиционными методиками.

Методы исследования антител к антигенам эритроцитов

  • Антиглобулиновый тест (непрямая реакция Кумбса) [показать] .

    Непрямой антиглобулиновый тест (НАТ) используется для выявления антиэритроцитарных антител. Обычно НАТ выполняется в два этапа:

    1. инкубация эритроцитов и сыворотки (фиксация антител) с последующим отмыванием для удаления несвязавшихся глобулинов; постановка непрямого антиглобулинового теста в гелевом тесте не требует отмывания эритроцитов!
    2. инкубация отмытых эритроцитов с античеловеческим глобулином (АЧГ). Агглютинация свидетельствует о наличии в сыворотке антител, связавшихся с антигенами эритроцитов in vitro.

    НАТ используется для:

    1. определения в сыворотке реципиента антител к эритроцитам донора - при постановке пробы на совместимость;
    2. при скрининге "неожиданных" антиэритро-цитарных антител;
    3. при исследовании антиэритроцитарных антител у беременных;
    4. при исследовании антител в сыворотке больных аутоиммунной гемолитической анемией.

    Ход определения:

    • внести в три расположенные слева пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси типированных эритроцитов;
    • добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;
    • центрифугировать ID-карты в течение 10 мин;
    • оценить результат исследования. Вписать полученный результат в ID-карту.

    Результаты определения:

    • положительный результат свидетельствует о наличии иммунных (алло) антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
    • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии иммунных антител в исследуемой сыворотке или плазме.
  • Ферментный метод [показать] .

    Обработка протеолитическими ферментами повышает агглютинабельность эритроцитов.

    Ход определения:

    • внести в расположенные справа три пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси стандартных типированных эритроцитов;
    • добавить в пробирки по 25 мкл Раствора для разведения 1;
    • добавить в пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки.

    Примечание: Раствор для разведения 1 не добавляется, если для исследования используются стандартные типированные эритроциты, предварительно обработанные протеолитическим ферментом (например, ID-DiaCell I-II-III P фирмы DiaMed).

    • инкубировать в течение 15 мин при температуре +37°С;
    • центрифугировать ID-карты в Ш-цент-рифуге в течение 10 мин (параметры установлены автоматически);
    • вписать полученный результат в ID-карту.

    Результаты исследования:

    • положительный результат свидетельствует о наличии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
    • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии аллоантител в исследуемой сыворотке или плазме.
  • Метод холодовой агглютинации [показать] .

    Ход определения:

    • выдержать Раствор для разведения 2, типированные эритроциты и ID-карты в течение 30 мин при температуре 2-8°С;
    • обработать типированные эритроциты Раствором для разведения 2, для чего:
      • промаркировать пробирку;
      • приготовить 0,8% взвесь типированных эритроцитов в Растворе для разведения 2, поместив в пробирку 1,0 мл Раствора для разведения 2 и 10 мкл крови.

    Примечание: стандартные эритроциты ID-DiaCell (фирмы DiaMed) готовы к использованию и не требуют разведения;

    • внести в три расположенные справа пробирки ID-карты по 50 мкл взвеси типированных эритроцитов, обработанных Раствором для разведения 2;
    • добавить в эти пробирки по 25 мкл исследуемой сыворотки;
    • инкубировать в течение 30 мин при температуре 2-8 С;
    • центрифугировать ID-карты в ID-центрифуге в течение 10 мин (параметры установлены автоматически);
    • оценить результат исследования;
    • вписать полученный результат в ID-карту. Результаты исследования:
    • положительный результат свидетельствует о наличии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме (для выяснения специфичности антител используется таблица, прилагаемая к стандартным эритроцитам);
    • отрицательный результат свидетельствует об отсутствии холодовых антител в исследуемой сыворотке или плазме.

    При наличии в исследуемой сыворотке холодовых или тепловых аутоантител могут наблюдаться ложноположительные результаты. Для исключения их необходимо поставить аутоконтроль:

    • приготовить 0,8% взвесь эритроцитов исследуемой крови в Растворе для разведения 2, добавив к 1,0 мл Раствора для разведения 2 10 мкл цельной крови;
    • внести по 50 мкл приготовленной взвеси эритроцитов в пробирку ID-карты, расположенную слева (для реакции Кумбса), или в пробирку ID-карты, расположенную справа (для ферментного метода и холодовой агглютинации);
    • в пробирки ID-карты внести по 25 мкл исследуемой сыворотки (для ферментного метода необходимо внести в пробирки еще по 25 мкл Раствора для разведения 1);
    • карты инкубировать 15 мин при температуре +37°С (для реакции Кумбса и ферментного метода) или при температуре 2-8°С (для постановки аутоконтроля холодовой агглютинации).

    Положительный результат в аутоконтроле свидетельствует о присутствии в исследуемой сыворотке аутоантител.

Определение совместимости крови донора и реципиента

Целью пробы на индивидуальную совместимость является предотвращение трансфузий гемокомпонентов, несовместимых по антигенам эритроцитов. Тестирование сыворотки реципиента с эритроцитами предполагаемого донора - наиболее надежный способ выявления антител, способных вызвать повреждение перелитых эритроцитов, посттрансфузионные реакции и осложнения гемолитического типа. Проведение такой пробы позволяет:

  1. подтвердить АВО-совместимость донора и реципиента;
  2. выявить антитела в сыворотке реципиента, направленные против антигенов эритроцитов донора.

Тестирование на индивидуальную совместимость крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов(табл.18.17 [показать] ) не заменяет обязательное имуногематологическое исследование (типирование антигенов эритроцитов систем АВО, Резус, Келл, выявление антиэритроцитарных антител, поиск и идентификацию аллоантиэритроцитарных антител), а лишь дополняет его.

Таблица 18.17. ID-карты, используемые для проведении пробы на совместимость
ID-карты Конфигурация
Complete Crossmatch A-B-D enz 2xAHG
DiaClon Complete Cross-match A-B-D(VI +)enz 2xAHG
LISS Coombs 6 AHG tests
Coombs anti-Ig G 6 AHG anti-lg G tests
NaCI Enz test and cold aggl 6 enz tests (or 6 NaCI tests)
ABD-Confirmation ABD ABD
DiaClon ABD-Confirmation A-B-D(VI -)A-B-D(VI -)

Ввиду того, что сенсибилизация может появиться даже после трансфузий индивидуально подобранных гемокомпонентов, для проведения проб на совместимость необходимо использовать каждый раз свежую сыворотку пациента, полученную после последней трансфузии гемокомпонентов.

Проба на совместимость должна быть проведена для каждого образца крови донора!

  • Ход определения [показать]
    • выдержать Раствор для разведения 2 до достижения комнатной температуры (20-24°С);
    • промаркировать ID-карты и пробирки (Ф.И.О. донора и реципиента);
    • приготовить 0,8% суспензию эритроцитов донора и реципиента в Растворе для разведения 2 для чего в две маркированные пробирки внести по 1 мл Раствора для разведения 2, добавить по 10 мкл крови донора и реципиента, соответственно;
    • смешать;
    • снять защитную фольгу с соответствующей ID-карты;
    • добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов донора в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 4, 5;
    • добавить по 50 мкл приготовленной суспензии эритроцитов реципиента в микропробирки ID-карты 4, 5, 6;
    • добавить по 25 мкл сыворотки или плазмы реципиента в микропробирки ID-карты 1, 2, 3, 6;
    • добавить 25 мкл Раствора для разведения 1 в микропробирку ID-карты 4 (ферментный тест);
    • инкубировать 15 мин при температуре +37°С;
    • центрифугировать (время и скорость центрифугирования постоянны и заданы автоматически);
    • оценить результат исследования. Совместимость по антигенам А, В, D (1, 2, 3 микропробирки):
    • четкий положительный или отрицательный результат указывает на соответствие антигенов А, В, О эритроцитов крови донора и реципиента;
    • если наблюдается двойная популяция эритроцитов (в одной микропробирке положительный и отрицательный результат) антигены А, В, D донора и реципиента не идентичны!
    • определение совместимости по антигенам А, В, D действительно только при отрицательной реакции в 6-ой микропробирке (аутоконтроль).
  • Результаты пробы на совместимость (4, 5 микропробирки) [показать]
    • положительный результат в микропробирках ID-карт 4, 5 при отрицательном контроле (микропробирка 6) свидетельствует о несовместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов;
    • отрицательный результат в микропробирках ID-карт 4, 5, 6 свидетельствует о совместимости крови донора и реципиента по антигенам эритроцитов;
    • положительная реакция в микропробирке ID-карты 6 (аутоконтроль) требует дальнейшего определения ауто- и аллоантител в сыворотке (плазме) реципиента.
  • Ограничения [показать]
    • определенные лекарственные средства могут вызывать ложноположительную реакцию Кумбса;
    • при некоторых патологических состояниях у больных может наблюдаться положительная реакция Кумбса;
    • бактериальное или другое загрязнение используемого материала может вызывать ложноположительный или ложноотрицательный результат;
    • остатки фибрина в исследуемых образцах могут связывать неагглютинированные клетки и после центрифугирования образовывать тонкую розовую линию на поверхности геля, тогда как большинство клеток будет локализовано на дне микропробирки;
    • суспензии эритроцитов, имеющие чрезмерную концентрацию, могут вызывать ложноположительные реакции.
  • Условия хранения и эксплуатации [показать]

    ID-карты ДиаМед должны храниться при комнатной температуре (+18-25°С) в сухом помещении в течение всего срока годности.

    Срок годности карт - 18 месяцев. Срок годности реагентов - 2 года.

    Результаты исследования на карте сохраняются в неизменном виде:

    • 48 ч при комнатной температуре;
    • три недели в холодильнике (при +2-8°С) при заклеенной липкой лентой верхней части ID-карты.

    Нижнее поле ID-карты можно отклеить или отрезать и использовать как документ в истории болезни или в картотеке.

    Не допускается использование ID-карт с признаками высыхания геля, пузырьками в его толще или повреждением защитной фольги.

    Перед использованием образцы и реагенты должны быть выдержаны до комнатной температуры.

Заключение

Гелевый тест является простым, воспроизводимым, быстрым и очень чувствительным методом, позволяющим сразу выявлять слабые варианты антигенов эритроцитов. Тест оценивается только макроскопически. После короткого обучения персонала, необходимого для правильного выполнения теста, сводятся к минимуму затраты рабочего времени и ошибки, встречающиеся при использовании традиционных методик.

Гелевый тест позволяет стандартизировать лабораторные методики, дать объективную оценку результатов реакции гемагглютинации. Стабильность результатов теста позволяет перепроверять полученные данные, что необходимо для контроля. Результаты теста могут быть фотокопированы для сохранения их в архиве или для учебных целей в сложнодиагностируемых случаях. Для теста используется небольшое количество сыворотки или эритроцитов, что чрезвычайно важно для педиатрических клиник.

Использование гелевой системы позволяет снизить риск заражения персонала даже при работе с потенциально инфицированными образцами. Гелевый тест может быть использован для проведения проб на совместимость по антигенам эритроцитов перед переливанием крови. Для этого используются непрямой антиглобулиновый тест и одностадийный ферментный метод.

Гелевый тест выполняется и оценивается по выше приведенным правилам. Отсутствие этапов отмывания эритроцитов при выполнении непрямого атиглобулинового теста позволяет более эффективно использовать рабочее время, а также благодаря стабильности результатов теста контролировать все полученные результаты.

  • Практическая трансфузиология / Ред. Козинец Г. И., Бирюкова Л. С., Горбунова Н.А. и др.- Москва: Триада-Т, 1996.- 435 с.
  • Руководство по военной трансфузиоло-гии / Ред. Э. А. Нечаев. - Москва, 1991. - 280 с.
  • Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е. П. Сведенцова. - Киров, 1999.- 716с.
  • Румянцев А. Г., Аграненко В. А. Клиническая трансфузиология.- М.: ГЭОТАР МЕДИЦИНА, 1997.- 575 с.
  • Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., Безопасное переливание крови: Руководство для врачей.- СПб.: Питер, 2000.- 320 с.
  • Шевченко Ю.Л., Жибурт Е.Б., Серебряная Н.Б. Иммунологическая и инфекционная безопасность гемокомпонентной терапии.- СПб.: Наука, 1998.- 232 с.
  • Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови / Пер. с англ.- М.- СПб.: Издательство БИНОМ - Невский диалект, 2000.- 448 с.
  • Blood transfusion in Clinical Medicine / Ed. P.L.Mollison, C. P. Engelfriet, M. Contreras.- Oxford, 1988.- 1233 p.

    • Источник : Медицинская лабораторная диагностика, программы и алгоритмы. Под ред. проф. Карпищенко А.И., СПб, Интермедика, 2001