Corynebacterium diphtheriae в систематике бактерий
По современной классификации вид входит в род коринебактерии (лат. Corynebacterium ), который относится к семейству Corynebacteriaceae , подпорядку Corynebacterineae , порядку Corynebacteriales (который недавно был выделен из порядка Actinomycetales ), классу Actinobacteria , типу Actinobacteria , <группе без ранга> Terrabacteria group , царству Бактерии.Дифтерия
Основным фактором патогенности является экзотоксин. Возбудители, продуцирующие экзотоксин, определяются как токсигенные штаммы. Существуют нетоксикогенные штаммы Corynebacterium diphtheria , не продуцирующие экзотоксин и не вызывающие заболевания. Способность к токсинообразованию проявляют лишь лизогенные штаммы , инфицированные бактериофагом (р-фаг), несущим ген fox, кодирующий структуру токсина дифтерии. Дифтерийный токсин представляет собой полипептид, состоящий из двух фрагментов: A и B. Фрагмент А проявляет ферментативную активность. Фрагмент В взаимодействует с клеточными рецепторами, облегчая проникновение фрагмента А.Дифтерия передаётся от больных или носителей токсикогенных штаммов , от человека к человеку. В зависимости от локализации процесса различают дифтерию ротоглотки, носа, гортани, трахеи, бронхов, глаза, уха, половых органов, кожи. В отдельных случаях имеет место одновременное поражение различных органов - комбинированная дифтерия. Наиболее часто дифтерийный процесс локализуется в ротоглотке. Клинические формы дифтерии ротоглотки крайне разнообразны и зависят от характера и распространения фибринозной пленки, степени отека слизистой оболочки ротоглотки и подкожной клетчатки шеи, выраженности интоксикации. Заболевание начинается остро с озноба или познабливания, повышения температуры тела, чаще не выше 38 °С, хотя на второй день болезни может быть более высокая температура. В это же время появляются и другие признаки интоксикации: головная боль, выраженная слабость, может быть обморочное состояние. С первых часов болезни появляется умеренная боль в горле при глотании, которая нарастает в течение суток. Подчелюстные лимфатические узлы при пальпации слегка болезненны, иногда умеренно увеличены. Лихорадочный период длится не более трёх дней. С нормализацией температуры практически исчезают все явления интоксикации, уменьшается или исчезает боль в горле при глотании (Ющук Н.Д. Кулагина М.Т.).
Дифтерия может быть причиной таких заболеваний желудочно-кишечного тракта, как острый гастрит , эзофагит и других.
Наиболее опасными осложнениями дифтерии являются отёк сердечной мышцы, сердечная недостаточность, истинный круп, кома, параличи, следствием чего возможен летальный исход.
Несмотря на активность ряда антибиотиков в отношении , они не очень эффективны при лечении дифтерии и если и применяются, то в качестве вспомогательных средств, при этом в качестве основного рекомендуется применять антитоксическую противодифтерийную сыворотку, подавляющую дифтерийный токсин.
Эффективным средством борьбы против дифтерии является вакцинация. В настоящее время распространены комбинированные вакцины, направленные сразу против нескольких заболеваний: АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная), АДСм (адсорбированная дифтерийно-столбнячная) и другие, например:
На сайте в разделе «Литература » имеется подраздел «Микрофлора, микробиоценоз, дисбиоз (дисбактериоз) », содержащий статьи, затрагивающие проблемы микробиоценоза и дисбиоза отделов ЖКТ человека.
Коринебактерии - грамположительные палочковидные микроорганизмы, широко распространенные в природе и обитающие в человеческом организме. Большинство представителей данного рода не патогенны для человека. Некоторые виды вызывают тяжелые инфекционные заболевания, например, .
Род Corynebacterium состоит из облигатных патогенов и возбудителей типичных оппортунистических инфекций. Каждый вид микроорганизмов имеет специфические биологические особенности и вызывает различные патологии. Чаще всего поражается кожа и внутренние органы. При введении нестерильных катетеров и установке зараженных протезов развивается бактериемия.
Коринебактерии - возбудители:
- Инфекции мочевыводящих путей - уретрита, простатита, поражения почек;
- Заболеваний органов дыхания - , ;
- Гнойно-септических процессов - бактериемии, септицемии, абсцесса мозга, остеомиелита, эндокардита, септического артрита,
- Кожных заболеваний - псевдомикоза;
- Катетер-ассоциированных и раневых инфекций.
Некоторые коринебактерии являются представителями различных нормоцинозов человеческого организма. Они обитают на коже, в верхних отделах респираторного тракта, зрительном анализаторе, урогенитальном тракте. Так, С. striatum обладает тропностью к кожным покровам, С. durum – к респираторному эпителию органов дыхания, С. glucuronoliticam - к эпителиоцитам мочеполового тракта у мужчин. Многие виды выделяются из объектов окружающей среды.
Атоксигенные С. diphtheriae в норме колонизируют кожу и зев, не вызывая развития болезни. Непатогенные виды коринебактерий в допустимом количестве входят в состав нормоценоза толстого кишечника. Но иногда эти микробы приводят к развитию инфекции и даже эпидемических вспышек. Такая особенность обусловлена наличием иных факторов вирулентности у данных микроорганизмов.
Все коринебактерии условно делятся на группы:
- Микроорганизмы, опасные для теплокровных,
- Микробы, поражающие растения,
- Условно-патогенные бактерии, не причиняющие вреда здоровью.
В наибольшей степени развитию инфекции подвержены дети, пожилые люди и лица с иммунодефицитом и полиорганной патологией. В большинстве случаев видовая идентификация corynebacterium spp вызывает значительные трудности, обусловленные их морфобиологическими особенностями.
Свойства коринебактерий
Коринебактерия дифтерии
Corynebacterium diphtheriae является возбудителем опасного для человека заболевания - дифтерии. В настоящее время патология регистрируется крайне редко и лишь у отдельных лиц, которые, скорее всего, не были своевременно вакцинированы.
Распространение инфекции происходит воздушно-капельным или контактным путем во время общения с больными людьми или через инфицированные предметы. В случае заражения пищевых продуктов становится актуальным алиментарный путь. В эпидемиологическом отношении наибольшую опасность представляют здоровые бактерионосители.
В зависимости от расположения первичного очага инфекции выделяют различные формы заболевания. Спустя 7-10 дней инкубации появляются первые клинические признаки. Фибринозное воспаление развивается в месте локализации патологического очага. Оно приводит к разрушению эпителиоцитов и кровеносных сосудов. В постепенно образующемся экссудате содержится много фибриногена, который сворачивается и образует налет на слизистой серо-белого цвета. Он плотно спаивается с подслизистым слоем и не поддается снятию. При попытке удалить налет начинается кровотечение. Кроме местных признаков воспаления, обусловленных локализацией входных ворот инфекции, возникает тяжелая интоксикация с лихорадкой, ознобом, гипергидрозом, ломотой в теле, вялостью, бледностью кожи, адинамией, гипотонией и прочими признаками.
Дифтерия зева - самая опасная форма инфекции, способная привести к развитию , который является причиной смертельного исхода. Он обусловлен отеком слизистой гортани и выраженной асфиксией.
Основным диагностическим методом дифтерии является микробиологический. При появлении плотных фибриновых пленок и отека глотки или других частей тела необходимо взять у больного мазок на дифтерию и начать данное исследование. Отделяемое зева, слизь из носа, налет с миндалин – биоматериал, который доставляют в бактериологическую лабораторию для проведения анализа. Его засевают на среды, содержащие сыворотку или кровь с теллуритом калия, который угнетает рост вторичной микрофлоры. После инкубации выросшие колонии микроскопируют, накапливают чистую культуру и проводят окончательную идентификацию до вида. Для клиницистов важны результаты серо- и фаготипирования. Определение токсигенности выделенной культуры имеет важное диагностическое значение.
Этиотропная терапия дифтерии заключается во введении больным антитоксической сыворотки, антибиотиков и сульфаниламидов. Симптоматическая и патогенетическая терапия улучшают общее состояние больных, избавляя их от симптомов. После снятия острых явлений патологии показаны санирующие физиопроцедуры – ультразвук и лазеротерапия непосредственно на очаг.
Чтобы предупредить развитие такого серьезного заболевания, как дифтерия, проводят всеобщую иммунизацию населения вакциной АКДС в соответствии с Национальным календарем прививок. Массовая вакцинация в настоящее время значительно снизила показатели заболеваемости дифтерией и смертности от нее.
Corynebacterium non diphtheriae являются обитателями внешней среды. Они обнаруживаются на коже и слизистой внутренних органов, являясь представителями нормоценозов. У ослабленных лиц из группы риска эти микробы способны вызывать воспалительные процессы, которые протекают также тяжело, как заболевания, вызванные безусловными патогенами. Чтобы правильно подобрать этиотропную терапию и вылечить больного, необходимо точно и быстро идентифицировать микроб.
Corynebacterium glucuronolyticum
Corynebacterium glucuronolyticum - микроорганизмы, выделенные от людей с заболеваниями мочеполовой системы. Они являются возбудителями простатита и уретрита у мужчин, но могут в оптимальном количестве обитать в организме здоровых людей, являясь представителями данного биоциноза.
Под воздействием негативных факторов происходит активный рост и размножение Corynebacterium glucuronolyticum. Бактерии начинают приобретать болезнетворные свойства, вызывая местное воспаление. Паренхима предстательной железы отекает, увеличивается в размере, инфильтрируется лимфоцитами. Воспаление распространяется на околожелезистую ткань, изменяется структура органа, разрушаются эпителиоциты, утрачивается секреторная функция железы.
Дифтероиды входят в состав нормоциноза урогенитального тракта мужчин наряду со стафилококками, энтерококками, единичными микоплазмами и уреаплазмами. В процессе сексуальной активности уретра заселяется потенциальными уропатогенными бактериями. При переохлаждении, нервном перенапряжении, длительном приеме антибиотиков возникает воспаление в простате, обусловленное условно-патогенными бактериями. При этом нарушаются функции местных факторов защиты организма.
Больные с простатитом или уретритом, вызванном Corynebacterium glucuronolyticum, жалуются на боли в промежности, мошонке, половом члене, усиливающиеся в конце акта мочеиспускания; дизурические расстройства: полиурию, никтурию, неполное опорожнение мочевого пузыря, слабую струю; половую слабость – расстройства эрекции и эякуляции.
Диагностические мероприятия:- Пальпация предстательной железы per rectum - изменение размеров железы, гетерогенная консистенции, чередование плотных и мягких участков, болезненные ощущения.В гемограмме - признаки воспаления.
- Бактериологическое исследование мочи и секрета простаты проводится в микробиологической лаборатории. Биоматериал засевают на стандартные среды для первичной идентификации, микроскопируют выросшие колонии, а затем изучают структуру, физиологию, ферментативную и биохимическую активность выделенного возбудителя. Corynebacterium glucuronolyticum хорошо растут на кровяном агаре. Через 24 часа на нем появляются выпуклые колонии беловато-желтоватого оттенка без зон гемолиза.
- ПЦР-диагностика - определение генетического материала коринебактерий в исследуемом образце.
Лечение простатита и уретрита противомикробное. Больным назначают фторхинолоны, макролиды и тетрациклины.
Corynebacterium glucuronolyticum - возбудитель заболеваний урогенитального тракта у мужчин. На сегодня инфекционный простатит и уретрит являются довольно распространенными недугами и серьезной медицинской проблемой. Специфические диагностические методы и терапевтические принципы остаются до конца не изученными. Больные, «заработав» подобный недуг, мучаются всю жизнь. Только эффективное антимикробное лечение поможет им справиться с патологией.
Дифтероиды - микроорганизмы из рода Corynebacterium, которые в настоящее время плохо изучены. К ним и относится данный микроб, имеющий еще одно название - палочка Хофмана. Его коринебактерия получила в честь своего первооткрывателя.
Corynebacterium pseudodiphtheriticum
Дифтероиды распространены повсеместно: они обнаруживаются в воздухе, почве, воде, на продуктах. Микробы обладают устойчивостью к факторам внешней среды - температуре, солнечному свету, влажности. Хлорамин и прочие хлорсодержащие дезинфектанты уничтожают их за пару минут. Дифтероиды обитают в различных биоценозах здорового человеческого организма - в носоглотке, на коже, в уретре, половых органах, сперме.
Признаки, отличающие данный вид от патогенных коринебактерий:
- Отсутствие волютина,
- Хаотичное расположение в мазке,
- Массивный рост на простых питательных средах при 37 градусах.
Corynebacterium pseudodiphtheriticum вызывает гнойно-воспалительные процессы при ослаблении макроорганизма вирусными инфекциями, стрессами, онкопатологиями, вторичным иммунодефицитом. При этом заболевание не развивается в местах обычного обитания бактерий. Они не способны к токсинообразованию. Проникая в кровь, коринебактерии способствуют развитию бактериемии. Известны случаи тяжелых бронхитов и пневмоний на фоне длительной иммуносупрессии. Эти микробы могут вызывать эндокардит, лимфаденит, дерматологические заболевания, инфекцию мочевыводящих путей.
Дисбиотические изменения развиваются в организме при увеличении количества дифтероидов до 10 в 5 или 6 степени микробных клеток. При этом возникают характерные клинические проявления.
Лечение заболеваний, вызванных Corynebacterium pseudodiphtheriticum, заключается в применении бактериофагов, антибиотиков, проведении плазмафереза и других способов очищения крови.
Если дифтероиды были выделены из крови, ликвора, мочи и других стерильных субстратов, их необходимо рассматривать как потенциальных возбудителей и проводить соответствующее лечение. В микробиологической лаборатории для этого ставят тест на чувствительность выделенного микроба к антибиотикам.
Видео: лекция – коринебактерии, этапы дифтерийной инфекции
Содержание статьи
Коринебактерии дифтерии
Впервые описана Э. Клебсом в 1983 г. и выделена Ф. Леффлером в 1984 г.Морфология и физиология
Коринебактерии дифтерии имеют характерную для всего рода форму. Они располагаются под углом друг к другу в виде римских пятерок. Зерна волютина выявляются при окраске уксуснокислой синькой по методу Нейссера, которая окрашивает только включения, не затрагивая цитоплазму. Дифтерийная палочка окружена микрокапсулой и имеет пили. С. diphtheriae требовательны к питательному субстрату. Они нуждаются во многих аминокислотах, углеводах, минеральных солях. Обычно их культивируют на свернутой сыворотке крови и на кровяном агаре с теллуритом калия. На последней среде образуют колонии двух типов: gravis - темно-серого цвета и mitis - черного цвета, которые отличаются друг от друга и по биохимическим признакам.Антигены
С. diphtheriae содержат в микрокапсуле К-антиген, позволяющий дифференцировать их на серовары и групоспецифический полисахаридный антиген клеточной стенки, который дает перекрестные серологические реакции с микобактериями и нокардиями. Патогенность и патогенез. Факторы вирулентности дифтерийных бактерий - пили и микрокапсула, с помощью которых они прикрепляются к эпителиоцитам миндалин, реже гортани, трахеи, полости носа, конъюнктивы глаза, вульвы. Затем происходит колонизация эпителиоцитов, что сопровождается возникновением воспалительного процесса. Токсичность связана с секрецией гистотоксина, который состоит из двух субъединиц: токсического полипептида и транспортного полипептида, ответственного за доставку токсического компонента к клеткам-«мишеням». Образование первого контролируется бактериальными генами, второго - генами фага, лизогенизировавшего бактериальную клетку. Это свидетельствует о том, что только лизогенные клетки С. diphtheriae могут секретировать гистотоксин.Фиксация гистотоксина происходит на рецепторах мембран мышечных клеток сердца, паренхимы сердца, почек, надпочечников, нервных ганглиев. При этом блокируется синтез белка на рибосомах, что, в конечном итоге, приводит к гибели клеток. При дифтерии, как правило, отсутствует бактериемия и септицемия в связи с локализацией С. diphtheriae в клетках гортани, где развивается фибринозно-некротическое воспаление с образованием пленок, лимфаденита и отеков, что может привести к асфиксии. Кроме дифтерии гортани С. diphtheriae вызывает дифтерию раневых поверхностей и половых органов. К дифтериеподобным коринебактериям относятся следующие: С. xerosis вызывает хронические конъюнктивиты, С. ulcerans - легкие формы дифтериеподобных заболеваний, С. pyogenes и С. haemolyticum - язвенно-некротические фарингиты, тонзиллиты, гингивостоматиты. С. pseudodyphtheriae является постоянным обитателем кожи и слизистых.Иммунитет
Напряженность постинфекционного иммунитета при дифтерии обусловлена высоким уровнем антитоксина в сыворотке крови. Образующиеся при дифтерии антибактериальные антитела - агглютинины, преципитины и другие - не обладают протективными свойствами. О наличии или отсутствии антитоксического иммунитета судят по реакции Шика - нейтрализации токсина антитоксином. При введении V40 DLM дифтерийного токсина в кожу предплечья появляется покраснение и припухание в случае отсутствия антитоксина в крови. При наличии антитоксина реакция Шика отрицательная.Экология и эпидемиология
Средой обитания для С. diphtheriae являются люди, в зеве которых они локализуются. Главным образом дифтерией болеют дети. Однако за последние 30 лет дифтерия «повзрослела». У взрослых дифтерия протекает тяжело и может закончиться летальным исходом. В окружающей среде бактерии дифтерии сохраняют жизнеспособность в течение нескольких дней, поскольку они переносят высушивание. Заражение происходит воздушно-капельным и реже контактным путем.Дифтерия
Дифтерия - острая, преимущественно детская инфекционная болезнь, которая проявляется характерным фибринозным воспалением в месте локализации возбудителя и сильной интоксикацией организма дифтерийными экзотоксин. Возбудителем ее является Corynebacterium diphtheriae, принадлежащего к роду коринебактерий. До этого рода входит еще около 20 видов бактерий, патогенных для людей, животных и растений. Из них наибольшее значение для практической медицины имеют следующие:1. С. ulcerans - может вызвать фарингит, поражение кожи, ее выявляют и у здоровых людей, в молочных продуктах и таре для их перевозки, некоторые штаммы токсигенные.2. С. jeikeium (ранее коринебактерии JK) - влечет пневмонию, эндокардит, перитонит, инфицирует раны, кожу.3. С. cistitidis (ранее коринебактерии группы D2) - инициирует образование камней в мочевыводящих путях и пневмония.4. С. minutissimum - вызывает эритразмы, абсцессы легких, эндокардит.5. С. haemolyticum - может вызвать тонзиллиты, целлюлит, абсцессы мозга, остеомиелит, хронические дерматиты.6. С. xerosis - раньше считали возбудителем ксероза (хронического конъюнктивита), теперь ее относят к сапрофитов.7. С. pseudodiphtheriticum - сапрофит, проживает на слизистой оболочке носоглотки человека.Взятие и доставка материала в лабораторию
Материалом для исследования пленка из миндалин, дужек, неба, язычка, слизь из зева и носа, реже выделения из глаза, уши, раны, влагалища, пораженного участка кожи. По требованию эпидемиолога исследуют смывы с игрушек и других предметов, некоторые пищевые продукты (молоко, мороженое). Материал нужно брать до начала этиотропного лечения натощак или через 2 ч после приема пищи.Для взятия материала используют тампоны, сухие или предварительно смоченные 5% раствором глицерина, помещенные в пробирку и простерилизованные вместе с ней. Исследуемый материал из ротоглотки и носа берут двумя отдельными тампонами, пытаясь взять его на границе здоровой и пораженной области вращательными движениями, не касаясь тампоном слизистой щек, зубов и языка, который прижимают шпателем. При ларингоскопии пленку или слизь берут непосредственно из гортани. Пленки и слизь изо рта и носа берут обязательно во всех случаях, даже при дифтерии редких локализаций (кожа, рана, глаз, ухо, вульва).Если необходимо провести первичную бактериоскопию по требованию врача, материал берут отдельным (дополнительным) тампоном или направляют часть отснятой пленки, тщательно растертой между двумя предметными стеклами.Тампоны после забора материала помещают в те же пробирки, на которых надписывают номер, дату и время отбора, фамилия врача. Они должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов после взятия материала. Если схема забора предусматривает занял у постели больного, то пробирки и чашки с посевами немедленно направляют в лабораторию или инкубируют при 37 ° С и доставляют через 20-23 ч, в холодное время в сумках с грелками.Бактериоскопическое исследование
Бактериоскопическое исследование материала от больного проводят только по требованию врача и только для того, чтобы распознать некротическую ангиной Симановского-Плаута-Венсана (выявление веретенообразных палочек и спирохет Венсана, которые при обычных методах культивирования не растут).На протяжении многих лет микроскопическое исследование и выявление зерен волютина, окрашенных по методам Леффлера и Нейссера, было основой лабораторной диагностики дифтерии и выявления бактерионосительства. Теперь, в связи с изменчивостью дифтерийных бактерий под воздействием антибиотиков, первичная микроскопия исследуемого материала не рекомендуется.Бактериоскопическое исследование проводится с целью идентификации нетипичных колоний на кровяно-телуритових средах и при проверке чистоты выделенных культур. Мазки окрашивают по Граму, Леффлером и Нейссером. Можно красить их уксуснокислым метиловым фиолетовым, толуидиновым синим или бентиазоловим и тиазиновых красителей.Дифтерийные палочки в мазках располагаются под углом, в виде латинских букв V, X, Y, или образуют скопления, напоминающие кучку разбросанных спичек. Волютина зерна располагаются, как правило, на полюсах микробных клеток. Псевдодифтерийни бактерии и дифтероиды размещаются параллельно (в виде "частокола") и, конечно, не имеют зерен волютина. Зерна Бабеша-Эрнста можно обнаружить с помощью люминесцентной микроскопии при окраске мазков корифосфином. Зерна приобретают оранжево-красного цвета на фоне желто-зеленых тел бактериальных клеток.Бактериологическое исследование
Клинический материал засевают на кровяной агар и кровяно-телуритовий агар (или среду Клауберга II), разлитые в чашки Петри. Посев на кровяной агар необходим для обнаружения и другой микрофлоры. Кроме того, некоторые штаммы Cdiphtheriae чувствительны к действию теллурита калия, поэтому их рост на телуритових средах может подавляться. Для выявления дифтерийного бактерионосительства посевы делают только на кровяно-телуритовий агар, поскольку в посевном материале может содержаться небольшое количество дифтерийных палочек, рост которых на неселективных средах будет подавляться другой микрофлорой. При этом допускается использование и транспортной среды.Кровяно-телуриновий агар
К 100 мл 2% расплавленного и охлажденного до 50 ° С питательного агара рН 7,6 добавляют 10-15 мл дефибринированной крови и 2 мл 2% раствора теллурита калия. Смесь тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри слоем, толщиной 3-4 мм.Среда Клауберга II
К 100 мл 3% питательного агара рН 7,6, расплавленного и охлажденного до 50 ° С, добавляют 3 мл 2% раствора теллурита калия, 10 мл глицериновой смеси и 50 мл гемолизированной крови. Глицериновую смесь готовят путем добавления 20 мл стерильного глицерина до 40 мл дефибринированной крови. Смесь можно хранить в холодильнике в течение 4-х месяцев. Для приготовления гемолизированной ("лаковой") крови до 34 мл стерильной дистиллированной воды добавляют 16 мл дефибринированной крови.Транспортная полужидкая среда
К 100 мл перевар Хоттингера или мясопептонного бульона добавляют 1 г любого коммерческого агара, устанавливают рН 7,6, стерилизуют в автоклаве при 112 ° С 30 мин, асептически добавляют 10 мл сыворотки и 1 мл 2% теллурита калия. Среду разливают в пробирки по 5 мл. При возможности используют и более сложное транспортное среду Эмес (AMIES), модифицированное Стюартом.Посев от одного больного производят на одну чашку, используя при этом одну половину среды для посева из ротоглотки (миндалин, дужек, язычка), а вторую - для посева другим тампоном из носа. Если есть изучаемый материал из кожи, глаза, уши и других локализаций - добавляют еще одну чашку. Нельзя сеять материал от нескольких больных на одну чашку. Среды перед посевом согревают в термостате 15-20 мин.При посеве исследуемого материала втирают тампоном сначала в отдельный участок кровяного агара площадью 2x1 см, затем аналогично на кровяно-телуритовому агаре (или среде Клауберга II), при этом тампон все время поворачивают, чтобы засеять из него весь материал. Затем тем же тампоном штрихами засевают остальные поверхности среды (половину чашки). Такая техника посева позволяет получить изолированные колонии (чистую культуру), которые используют непосредственно из чашки для определения токсигенности и последующей их идентификации. Засеяны чашки или пробирки с транспортным средой инкубируют в термостате при 37 ° С в течение 20-24 час.На второй день с помощью стереоскопического микроскопа исследуют характер колоний. Если рост отсутствует на обеих средах, делают повторный забор материала.Чашки с типичными и подозрительными на C.diphtheriae колониями отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопию подозрительных колоний можно не проводить.Колонии дифтерийных палочек на кровяном агаре беловатого или желтоватого цвета, непрозрачные, круглой, слегка выпуклой формы, диаметром 1-2 мм. Обычно они имеют маслянистую консистенцию, хотя некоторые могут образовывать хрупкие жесткие R-колонии.На кровяно-телуритових средах KonomiC.diphtheriae через 24 часа роста имеют серый цвет, выпуклые, с ровным краем, вязкие. Через 48 ч они приобретают темно-серого или черного цвета с металлическим блеском, равными или слегка фестончатыми краями, гладкой или с радиально исполосовано поверхностью (R-формы), вязкие или хрупкие при прикосновении петлей.По структуре 48-часовых колоний на телуритових средах и некоторыми ферментативными признаками возбудителя дифтерии выделяют четыре культурально-биохимических варианта (биовары) - gravis, mitis, belfanti, intermedius.Биовар gravis обычно образует серые или черные матовые сухие колонии, хрупкие, плоские, гладкие, диаметром 1,5-2 мм, с радиально исполосовано поверхностью, он высокотоксичный, не вызывает гемолиза, разлагает крахмал и гликоген.Биовары mitis и belfanti растут в виде серых или черных, круглых гладких выпуклых колоний с ровными краями, диаметром 1-1,5 мм эти варианты менее токсичны, вызывают гемолиз, но не разлагают крахмал и гликоген.Биовар intermedius образует мелкие, серые, прозрачные колонии диаметром 0,5-1 мм, с плоской гладкой поверхностью, он слаботоксичный, не расщепляет крахмала и гликогена.Если типичный рост отсутствует, из других, сомнительных колоний готовят мазки. При обнаружении в них споровых палочек, кокков, дрожжей и др.., Исследования на дифтерию прекращают и дают отрицательный ответ. Однако, важно помнить, что дифтерийные бактерии, которые образовали нетипичные колонии на средах с ингибиторами роста (теллурит калия), могут быть укорочены, утолщены, но сохраняют полиморфизм и характерное местоположение.При росте типичных колоний сразу же приступают к изучению их токсигенности и идентификации. Токсигенные свойства исследуют не менее в 2-х изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и непрожженные петлей на среду Пизу, а второй половины - на скошенный сывороточный агар для выделения чистой культуры и сохранения ее до окончания лабораторной диагностики. В случае, если на чашке вырастают одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности С. diphtheriae, необходимо при множественном росте подозрительных колоний исследовать токсигенные свойства около 20 колоний, засевая в одну бляшку материал из 5-6 колоний. При росте всего одной колонии, ее засевают на среду для определения токсигенности и, прокаливая петлю, - в пробирку со средой Пизу.Если использовали транспортную среду, висел из него делают в плотные кровяно-теллурита среды.На третий день, при появлении специфических линий преципитации в агаровом геле и положительной пробе на цистиназу, выделенную культуру определяют как токсигенные С. diphtheriae. Если линии преципитации через 24 часа отсутствуют, чашки инкубируют еще в течение суток. В случае отрицательной пробы Пизу культуру идентифицируют как вид коринебактерий.Чистую культуру на скошенном сывороточном агаре высевают на углеводородные среды с глюкозой, сахарозой, растворимым крахмалом, ставят пробы на выявление уреазы, пиразинамидазы и нитратредуктазы.На четвертый день делают учет результатов всех посевов и выдают аргументированный бактериологический вывод о выделенную культуру.Используют такие методы идентификации коринебактерий.Определение токсигенности in vitro
В его основе лежит взаимодействие токсина с антитоксином в агаровом геле. В местах оптимального количественного соотношения токсина и антитоксина в толще агара выпадает преципитат в виде тонких нежных белых линий ("стрелы", "усики"). Этот тест во многих странах за рубежом называют Элек-тестом.Пробу на токсигенность, как правило, проводят с чистыми культурами. Можно определить его и с культурами, загрязненными посторонней микрофлорой, в сутки ускоряет лабораторную диагностику дифтерии. Но при отрицательной пробе ее повторяют с выделенной чистой культурой.Для постановки этой пробы микробиологическая промышленность выпускает специальное сухое стандартное среду для определения токсигенности дифтерийных микробов (ВТДМ) и стандартные бумажные диски, пропитанные антитоксической противодифтерийной сывороткой и высушены.На поверхность свежеизготовленного среды ВТДМ накладывают бумажные диски с антитоксином (не более четырех на одну чашку). На расстоянии 0,5 см от диска вокруг него засевают культуры в виде "бляшек" диаметром 7-8 мм, чередуя "бляшки" изучаемой культуры и контрольного штаммаРезультаты учитывают через 18-24 и 48 год. Критерием специфичности преципитатов является слияние линий преципитации исследуемой культуры с линиями токсигенного штамма. В таком случае выделенную культуру считают токсигенных.При отсутствии стандартных бумажных дисков можно использовать полоски фильтровальной бумаги, пропитанные дифтерийными антитоксином. их изготавливают непосредственно в лаборатории. Нарезанные по указанным размерам и простерилизованные в автоклаве при 121 ° С в течение 30 мин бумажные полоски смачивают 0,25 мл очищенного дифтерийного антитоксина, который содержит 500 МЕ в 1 мл. В таком случае на чашку с соответствующим средой накладывают смоченную антитоксином полоску бумаги, подсушивают, открыв чашку на 15-20 мин в термостате и перевернув ее вверх дном. После этого с обеих сторон полоски засевают культуры "бляшками", чередуя исследуемые и контрольные штаммы.Для определения токсигенности возбудителя дифтерии можно использовать также и другие среды (АГВ, мартеновский агар и др.), рецепты изготовления которых приведены в "Инструкции по бактериологической диагностики дифтерии", Киев (1999).На протяжении многих лет токсигенность дифтерийных бактерий определяли подкожно или внутрикожно введением культуры двум гвинейским свинкам, одной из которых накануне вводят 100-1000 МЕ антитоксической противодифтерийной сыворотки. Теперь этот метод бактериологические лаборатории практически почти не используют из-за дороговизны и значительную задержку ответа.В последнее время разработаны очень чувствителен и высокоспецифичным метод определения гена дифтерийного токсина путем полимеризации цепной реакции. Он базируется на определении участка ДНК С. diphtheriae, где локализован ген дифтерийного токсина, с помощью специфических праймеров. Метод имеет преимущества перед традиционным определением токсигенности: высокую чувствительность, быстрота получения результатов (4-6 ч), не требует выделения чистой культуры. Но для его проведения необходимы специальная аппаратура, дорогие реактивы и соответствующее помещение, а потому может быть проведен лишь в специализированной лаборатории. Все нетоксигенные штаммы дифтерийных бактерий, выделенные от больных и бактерионосителей, необходимо направлять в Украинский центр госсанэпиднадзора (где есть такая лаборатория) для окончательного определения токсигенных свойств С. diphtheriae.Определение цистиназы (проба Пизу)
С. diphtheriae, С. ulcerans выделяют фермент цистиназу, псевдодифтерийни бактерии и другие дифтероиды его производят.Выделенную культуру засевают уколом в среду с цистином, разлитое столбиком в узкие пробирки. Цистиназопозитивни бактерии расщепляют цистин с выделением сероводорода, который с уксуснокислым свинцом, входящий в среде, образует сернокислый свинец, в результате чего среда окрашивается в темно-коричневый цвет. С. diphtheriae вызывает не только потемнение среды за ходом укалывания, а образует вокруг него "облако" темно-коричневого цвета на расстоянии 1 см от поверхности. Результаты учитывают через 20-24 ч инкубирования в термостате.Определение уреазы (проба Заксе)
Дифтерийные бактерии этого фермента не образуют. Положительную пробу на уреазу дают лишь некоторые другие виды коринебактерий. Для постановки пробы выделенную культуру сеют в бульон с мочевиной. Уреаза разлагает мочевину, изменяет рН среды, сопровождающееся его покраснением. Если фермент не выделяется, изменения окраски бульона не происходит.Определение пиразинамидазы
Определение пиразинамидазы проводят путем гидролиза пиразинамида в пиразиновой кислоты и аммония. Для этого в стерильную пробирку вливают 0,25 мл стерильной дистиллированной воды, в которой готовят густую взвесь выделенной культуры, затем вносят одну диагностическую таблетку Rosko 598-21. Инкубируют в течение 4-х часов при 37 ° С, после чего добавляют одну каплю только что приготовленного 5% водного раствора сульфата аммонийного железа. При наличии фермента суспензия приобретает красного или оранжевого цвета. Патогенные коринебактерии не выделяют пиразинамидазу, а следовательно, не изменяют цвета суспензии.Сахаролитические ферменты
Сахаролитические ферменты определяют путем посева полной петли выделенной культуры в каждую пробирку укороченного пестрого ряда Гисса (глюкоза, сахароза, растворимый крахмал). Результаты учитывают через 24 ч инкубации в термостате. Расщепление крахмала может задерживаться до 48 час.Определение нитратредуктазы
Определение нитратредуктазы является дополнительным тестом для идентификации С. belfanti и С. ulcerans, которые не образуют этого фермента. В пробирку с бульоном, в который добавляют 0,1% KN03, засевают исследуемую культуру, инкубируют в термостате в течение суток. Обязательном контроле со незасеянными средой. В случае наличия нитратредуктазы при добавлении к засеянного бульона 3-х капель реактива Касаткина возникает красное окрашивание. Среда в контрольной пробирке цвета не меняет.Для идентификации коринебактерий последнее время используют бумажные индикаторные диски с глюкозой, сахарозой, мочевиной и крахмалом из набора "Б" для идентификации энтеробактерий (фирма "ИмБио", г.Нижний Новгород). В 4-х пробирках готовят густую взвесь исследуемой культуры и в каждую из них погружают диск с соответствующим углеводом или иным реактивом. После инкубирования в термостате учет выделения уреазы проводят через 40-120 мин, а определение сахаролитических активности - через 5-24 часов. При наличии уреазы белый диск с мочевиной становится розово-малиновым, при отсутствии - остается белым. Диски с глюкозой и сахарозой при наличии соответствующих ферментов уже через 5-6 ч меняют цвет с красного на желтый. При определении амилазы в пробирку с соответствующим субстратом добавляют индикаторный диск с йодом. Если фермента нет - появляется темно-синюю окраску, если есть - цвет раствора остается без изменений.Специфическая профилактика и лечение
Вакцинопрофилактика дифтерии проводится при введении дифтерийного анатоксина, полученного при обработке дифтерийного токсина формалином. В нашей стране для вакцинации используют АКДС - адсорбированную коклюшно-дифтерийно-столбнячную вакцину. Антитоксическую сыворотку применяют для специфической терапии, а антибиотики - для санации бактерионосителей. Из антибиотиков используют пенициллин, ванкомицин, эритромицин и др.Corynebacterium diphtheriae был обнаружен, а затем выделен в чистой культуре 100 лет тому назад. Окончательное его этиологическое значение в возникновении дифтерии было подтверждено спустя несколько лет, когда был получен специфический токсин, вызывающий гибель животных при явлениях, сходных с наблюдаемыми у больных дифтерией. Corynebacterium diphtheriae относится к роду Corynebacterium, группе коринефромных бактерий. Corynebacterium diphtheriae представляют собой прямые или слегка изогнутые палочки с расширениями или заострениями на концах. Деление на излом и расщепление обеспечивают характерное расположение в виде римской цифры V или растопыренных пальцев, но нередко в мазках встречаются единично расположенные палочки. Большие их скопления, которые бывают в мазках, приготовленных из слизи зева, носа, раневого отделяемого, имеют войлокообразный характер. Средняя длина палочек их 1-8 мкм, ширина - 0,3/0,8 мкм. Они неподвижны, спор и капсул не образуют. Corynebacterium diphtheriae являются факультативным анаэробом. Дифтерийные палочки устойчивы к высушиванию. При температуре 60 °С в чистых культурах разрушаются в течение 45-60 мин. В патологических продуктах, т. е. при наличии белковой защиты, могут сохранять жизнеспособность в течение часа при температуре 90 °С. Низкие температуры не оказывают губительного действия на дифтерийные палочки. В дезинфицирующих средствах обычной концентрации они быстро погибают.
Необходимо отметить чрезвычайно большой полиморфизм дифтерийных палочек, проявляющийся в изменении их толщины и формы (вздутые, колбовидные, сегментированные, нитевидные, ветвящиеся), В концевых утолщениях, а иногда и в центральной части уже через 12 ч роста культуры при специальной окраске обнаруживаются зерна Бабеша-Эрнста, представляющие собой скопления волютина. Имеются данные, что волютин является длинно-цепочным неорганическим полифосфатом. М. А. Пешков предполагает их метафосфатную природу. А. А. Имшанецкий считает, что волютин является побочным продуктом обменных процессов. Известно, что для образования зерен необходим фосфор. Имеются предположения и о необходимости марганца и цинка для этого процесса.
Волютиновые зерна встречаются в суточных культурах, а затем число бактерий с наличием зерен снижается, В цитоплазме имеются также нуклеотид, внутрицитоплазматические мембраны - лизосомы, вакуоль.
Окрашиваются бактерии всеми анилиновыми красками. При окраске по методу Грамма - положительные. Для окраски волютиновых зерен используется метод Нейссера. При окраске этим методом зерна волютина, обладающие большим сродством к метиленовому синему, стойко окрашиваются в синий цвет, а из тела бактерии при дополнительной окраске хризоидином или бисмаркбрауном метиленовый синий вытесняется.
Возбудитель дифтерии - гетеротроф, т. е. относится к группе бактерий, требующих для своего роста органические вещества. Используемые для выращивания среды должны содержать в качестве источника углерода и азота аминокислоты - аланин, цистин, метионин, валин и др. В связи с этим элективными средами для культивирования являются среды, содержащие животный белок: кровь, сыворотку, асцитическую жидкость. На основании этого и была создана классическая среда Леффлера, а затем среды Клауберга, Тиндаля, среда накопления.
На среде Леффлера колонии дифтерийной палочки имеют блестящую, влажную поверхность, ровные края, желтоватую окраску. Через несколько суток роста появляется радиальная исчерченность колоний и слабо выраженные концентрические линии. Диаметр колоний достигает 4 мм. Первые признаки роста появляются после 6 ч пребывания в термостате при 36-38 °С. Отчетливо виден рост спустя 18 ч после посева. Оптимальное значение рН для роста дифтерийной палочки 7,6. Коринебактерии дифтерии очень часто трудно отличимы от других видов коринебактерии. Для определения вида используется комплекс культуральных и биохимических признаков.
Неоднороден и вид коринебактерии дифтерии, он подразделяется на 3 культурально-биохимических типа gravis, mitis, intermedins, на две разновидности - токсигенные и нетоксигенные, ряд серологических типов и фаготипов.
В настоящее время на большинстве территорий циркулируют два культурально-биохимических типа - gravis и mitis. Тип intermedins, который раньше выделялся также достаточно широко, последнее время встречается редко. Наиболее четко дифференциацию типов можно провести по форме колоний при выращивании культуры на кровяном агаре с добавлением теллурита. Колонии типа gravis через 48-72 ч достигают в диаметре 1-2 мм, имеют волнистые края, радиальную исчерченность и плоский центр. Их вид принято сравнивать с цветком маргаритки. Колонии матовые благодаря способности бактерии восстанавливать теллурит, который затем соединяется с образующимся сероводородом, серо-черного цвета. При росте на бульоне культуры типа gravis образуют на поверхности крошащуюся пленку. При посеве на среды Гисса с добавлением сыворотки они расщепляют полисахариды - крахмал, декстрин, гликоген с образованием кислоты.
Культуры типа mitis на кровяном агаре с теллуритом вырастают в виде круглых, слегка выпуклых, с ровным краем, черных матовых колоний. При росте на бульоне дают равномерную мутность и осадок. Крахмал, декстрин и гликоген они не расщепляют.
В мазках палочки типа gravis чаще короткие, а типа mitis более тонкие и длинные.
Сравнительное электронно-микроскопическое исследование дифтерийных палочек различных биохимических типов показало наличие у типов gravis и mitis трехслойной клеточной оболочки. Оболочка у типа intermedins двухслойная и почти в 3 раза толще. Между цитоплазмой и оболочкой имеются пространства, заполненные зернами, которые, возможно, имеют отношение к экзотоксину. Видна косая исчерченность бактерий, которую создают разделительные стенки между дочерними клетками. Хромосомный аппарат, у типов gravis и mitis представлен обычными зернами с вакуолями, у типа intermedins - распределен по всей цитоплазме. В электронном микроскопе видна многослойная оболочка, наличие которой объясняет, почему дифтерийные палочки иногда бывают грамотрицательными.
Колонии дифтерийных бактерий бывают в S-, R- и SR-формах, последние считаются промежуточными. Н. Morton считает, что колонии S-форм присущи типу mitis, SR-форм - типу gravis. Кроме этих основных форм встречаются колонии мукоидного типа - М-формы, карликовые колонии - D-формы и гонидиальные колонии - L-формы. Все они считаются формами диссоциативной изменчивости.
Дифтерийные бактерии необходимо отличать от дифтероидов и ложнодифтерийной палочки.
Большое количество исследований посвящено вопросам изменчивости дифтерийной палочки. Возможность возникновения атипичных форм в лабораторных условиях была подтверждена работами эпидемиологического профиля.
Признаваемая большим числом исследователей биохимическая, морфологическая, физико-химическая изменчивость дифтерийной бактерии затрудняет в ряде случаев бактериологическую диагностику, заставляет проводить комплексное изучение культур.
Мы распределили все культуры, выделенные в условиях различной эпидемиологической обстановки, на 8 групп; они включили все возможные морфологические варианты интересующих нас представителей коринебактерии:
1-я группа - короткие палочки, длиной около 2 мкм, без зерен;
2-я группа - короткие палочки, длиной около 2 мкм, но изредка с зернами;
3-я группа - палочки средней величины, длиной 3-6 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм, без характерной зернистости;
4-я группа - палочки средней величины, длиной 3-7 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм, слегка изогнутые, изредка с зернами;
5-я группа - палочки средней величины, длиной 3- 6 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм, слегка изогнутые, зернистые;
6-я группа - длинные палочки, длиной 6-8 мкм, шириной 0,3-0,6 мкм, слегка изогнутые, изредка с зернами;
7-я группа - длинные палочки, длиной 6-8 мкм, шириной 0,3-0,8 мкм, обычно изогнутые, без зерен;
8-я группа - короткие, грубые палочки, длиной около 2 мкм, шириной около 1 мкм, без зерен.
Расположение палочек при распределении по группам не учитывалось, но обычно характерное расположение соответствовало морфологии.
В 1, 2, 3 и 8-й группах, которые соответствовали по морфологии палочкам Гофмана, расположение было групповое, параллельное или в виде единичных особей, в 4, 5 и 6-й группах, в основном соответствующих по морфологии истинным дифтерийным бактериям, палочки располагались под углом или в виде единичных особей. В 7-й группе палочки чаще располагались беспорядочно, переплетаясь между собой. В 8-й группе палочки располагались в виде единичных особей.
Из 428 изученных культур 111 по совокупности признаков должны были быть отнесены к истинным дифтерийным, 209 явились культурами палочек Гофмана и 108 составили группу атипичных культур. У культур, близких к дифтерийным, атипичность проявлялась в снижении биохимической активности, иногда в разложении мочевины; у культур, морфологически близких к палочкам Гофмана, в сохранении положительной цистеиновой пробы, способности разлагать один из сахаров.
Из 111 дифтерийных культур морфологически типичной была 81 культура (73%), 28 культур (27%) имели морфологию палочек Гофмана. Из 111 дифтерийных культур было 20 культур типа gravis и из них только 9 отнесены к 1 и 2-й морфологическим группам.
Культуры, которые были отнесены по совокупности признаков к культурам палочки Гофмана, в 20% случаев имели морфологию типичных дифтерийных культур.
К атипичным культурам отнесено 25% изученных штаммов, их морфология соответствовала как дифтерийным палочкам, так и палочкам Гофмана.
Таким образом, биохимические и морфологические свойства культур далеко не всегда совпадают, причем биохимическая атипичность, так же как и морфологическая, чаще наблюдается у культур, выделенных в период снижения заболеваемости, а значит, и снижения уровня носительства.
Необходимо отметить общее снижение биохимической активности культур за последние 10-15 лет. Показателем этого является запоздалая ферментация сахаров, наступающая иногда на 5-6-е сутки, а также различная биохимическая активность колоний одной и той же культуры.
Биохимическая идентификация чистых культур, выделенных в условиях различной эпидемиологической обстановки, показывает, что хотя морфология и биохимические свойства часто не совпадают, общий принцип распределения культур, установленный по данным морфологии, не изменяется. Как при распределении культур по морфологическим и биохимическим данным, так и при полной их идентификации с включением серологических реакций принцип распределения остается тот же: атипичные культуры чаще встречаются в период эпидемического благополучия, палочки Гофмана чаще обнаруживаются в период эпидемического неблагополучия и высеваются дольше истинных дифтерийных.
Изучение токсигенных свойств выделенных, культур на твердых питательных средах показало, что даже в период эпидемического благополучия встречается достаточное число носителей токсигенных дифтерийных палочек. Необходимо отметить, что токсигенные свойства не всегда удается уловить даже у культур, выделенных от больных. Это говорит о необходимости совершенствовать применяемые методики определения токсигенности культур.
Результаты реакции агглютинации атипичных культур, выделенных в условиях различной эпидемиологической обстановки, показали наличие тех же закономерностей для серологических свойств, которые были отмечены нами при изучении морфологии и биохимии культур. Атипичность культур, выделенных в благополучном районе, по данным серологии была более глубокой, чем в неблагополучных районах. Так, в благополучном районе положительную реакцию агглютинации давали 26% атипичных культур, в неблагополучных - 19%.
Одним из основных свойств дифтерийной палочки является способность к токсинообразованию. Токсиногенез коринебактерии дифтерии детерминируется геном, содержащимся в профаге, следовательно, основное средство агрессии - токсинообразование не связано с хромосомой бактерий.
Дифтерийный токсин представляет собой белок с молекулярной массой 6200 дальтон. Сила токсина определяется путем постановки внутрикожных проб по наличию некротического действия и по воздействию на восприимчивых животных (летальное действие). Сила токсина измеряется с помощью минимальной смертельной дозы, представляющей собой то наименьшее количество токсина, которое способно вызывать гибель гвинейской свинки массой 250 г на 4-5-е сутки при внутрибрюшинном введении. Токсин обладает антигенными свойствами, которые сохраняются при обработке формалином, снимающим его ядовитые свойства. Это позволило использовать его для приготовления профилактического препарата.
Молекула токсина состоит из двух фрагментов, один из которых термостабилен и обладает ферментативной активностью, а второй термолабилен и выполняет протективную функцию. Доказано внутриклеточное синтезирование токсина с выделением его через канальцы клеточной стенки. Синтез токсина происходит при выращивании микроба в жидкой среде - мясо-пептонном бульоне с добавлением глюкозы, мальтозы и факторов роста при рН 7,8-8,0.
По последним данным, дифтерийный токсин является продуктом вирусного происхождения. В качестве подтверждения И. В. Чистякова выдвигает способность нетоксигенных коринебактерии превращаться в токсигенные под влиянием фага. Возможность конверсии нетоксигенных культур в токсигенные была подтверждена в опытах на одноклеточных культурах. Описанный феномен носит название лизогенной конверсии. С помощью умеренных вирусов, полученных из токсигенных штаммов gravis, удалось конвертировать нетоксигенный вариант коринебактерии дифтерии gravis в токсигенный.
Э. В.Бакулина, М.Д.Крылова предположили, что очаговая конверсия может иметь значение в эпидемическом процессе. В связи с этим было начато изучение ее роли в формировании токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии в природе. Была показана возможность осуществления конверсии токсигенности не только в системах фаг - бактерии, но и в природных условиях. Но среди местных культур этот процесс, по данным ряда исследователей, осуществляется далеко не часто. Причинами этого, вероятно, являются отсутствие продуцентов умеренных фагов, отличная от эталонных штаммов фагочувствительность местных штаммов, в связи с чем они не могут быть реципиентами конвертирующих фагов известного спектра действия.
Только в части микробной популяции удавалась конверсия токсигенных свойств у дифтерийных палочек под действием стафилококковых и стрептококковых фагов. В работах последних лет вопрос фаговой конверсии в эпидемическом процессе получает еще более сдержанную оценку. Считают, что коринефаги tox+ в эпидемическом процессе дифтерии не играет самостоятельной роли. Носители нетоксигенных палочек могут инфицироваться фагом tox+ только вместе с токсигенным штаммом, а стафилококковые фаги не способны конвертировать нетоксигенные коринебактерии. Для осуществления конверсии в направлении токсигенности в организме человека необходимо, по-видимому, наличие близкого общения носителя, имеющего конвертирующий фаг, с носителем, выделяющим лизочувствительный к этому фагу штамм. Кроме способности к токсинообразованию дифтерийная бактерия обладает такими факторами патогенности, как гиалуронидаза, нейраминидаза, дезоксирибонуклеаза, каталаза, эстераза, пероксидаза. Изучение внеклеточных продуктов метаболизма показало отсутствие различий между токсигенными и нетоксигенными коринебактериями дифтерии.
В настоящее время для внутривидового типирования коринебактерии дифтерии кроме описанного выше биохимического метода могут быть использованы серологический и фаговый.
Наличие серологических типов обусловлено типоспецифическими, термостабильными, поверхностными и термолабильными антигенами.
Существует ряд схем серологического типирования. У нас в стране используется схема, предложенная В. С. Сусловой и М. В. Пелевиной, но она не может обеспечить классификацию всех нетоксигенных штаммов. Количество серологических типов растет. I. Ewing установила наличие 4 серологических типов - А, В, С и D; D. Robinson и A. Peeney 5 типов - I, II, III, IV и V. Л. П. Делягина выделила еще 2 серологических типа. Считают, что число серологических типов значительно больше, причем в основном за счет типа mitis. Из имеющихся немногочисленных данных литературы закономерностей в выделении того или иного серотипа при различных формах инфекционного процесса и различной эпидемиологической обстановки не установлено. Наряду с данными о различной агрессивности культур, принадлежащих к разным серологическим типам имеются сообщения, в которых отвергается связь серологического типа с патогенностью культур.
Характерно, что на различных территориях встречаются разные серологические типы. Серологическое типирование может быть использовано для эпидемиологического анализа.
В условиях спорадической заболеваемости, ограничения числа носителей, когда значительно сложнее поиски источника инфекции, приобретает значение метод фаготипирования, позволяющий подразделять коринебактерии на серологические и культуральные варианты. Маркирование может производиться по свойствам выделенных из культуры фагов и по чувствительности культуры к специфическим бактериофагам. Наиболее широко используется схема, предложенная R. Saragea и A. Maximesco. Она позволяет маркировать токсигенные и нетоксигенные штаммы всех культуральных вариантов. С помощью 22 типовых фагов культуры могут быть подразделены на 3 группы, в которых объединен 21 фаговариант: 1-я группа - токсигенные и нетоксигенные штаммы типа mitis (фаговарианты I, la, II, III); 2-я - токсигенные и нетоксигенные штаммы типа intermedins и нетоксигенные gravis (фаговарианты IV, V, VI, VII); 13 фаговариантов (от VIII до XIX) вошло в 3-ю группу, которая объединила gravis токсигенные штаммы.
Схема была апробирована на большом числе штаммов, выделенных в Румынии и полученных из музеев 14 стран. Фаготипирование было положительным у 62% штаммов, особенно успешно были промаркированы штаммы типа gravis. Среди последних принадлежность к одному из фаговариантов была установлена в 93%. Специфические реакции с типовыми фагами у токсигенных штаммов типа gravis по схеме этих авторов основаны на инфицировании штаммов различными вирусами.
В нашей стране исследования в области фаготипирования проводила М. Д. Крылова. Автор разработал схему фагового маркирования, в основу которой положен принцип, предложенный Williams и Rippon для типирования плазмокоагулирующих стафилококков: фаговариант обозначался названием типового фага, который его лизировал в тест-разведении. Фаги и фаговарианты в схеме М. Д. Крыловой обозначаются буквами латинского алфавита: прописными - фаги, дающие сливной и полусливной лизис, строчными - лизис в виде бляшек. На основании этого разработаны модифицированная схема фаготипирования нетоксигенных коринебактерии варианта gravis, и схема фаготипирования токсигенных коринебактерии варианта gravis.
1. КОРИНЕБАКТЕРИИ
К роду Corynebacterium относятся бактерии, имеющие булавовидные утолщения на концах: коринебактерии, патогенные для человека и животных, и дифтероиды (непатогенные и условно-патогенные коринебактерии).
Возбудитель дифтерии
Открытию возбудителя дифтерии предшествовали обширные клинические, патологоанатомические, эпидемиологические и экспериментальные исследования, которые в значительной степени подготовили почву для его обнаружения (Клебс Э., 1883), выделения в чистой культуре (Леффлер Ф. , 1884), получения токсина (Ру Э. и Иерсен А., 1888), антитоксической сыворотки (Беринг Э., Китазато, 1890, Ру Э., 1894) и дифтерийного анатоксина (Рамон Г. , 1923).
Морфология. Дифтерийные коринебактерии – Corynebacterium diphtheriae (лат. согуnа булава, diphthera – пленка, кожа) прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1 8 мкм и шириной 03 0,8 мкм, полиморфные, лучше окрашиваются по полюсам, на которых расположены метахроматические гранулы волютина (зерна Бабеша Эрнста, полиметафосфаты) У дифтерийных коринебактерий наблюдаются булавовидные утолщения по концам, содержащие зерна волютина, иногда появляются ветвистые и нитевидные формы, а также короткие образования, почти кокковидные и дрожжеподобные. В мазках они располагаются V-образно (под углом), принимая вид растопыренных пальцев. Они не образуют спор, капсул и жгутиков, грамположительны.
Культивирование. Возбудитель дифтерии аэроб или факультативный анаэроб, хорошо культивируется на средах, содержащих белок (свернутой сыворотке, кровяном агаре, сывороточным aгapе), а также на сахарном бульоне. На среде Ру (свернутая лошадиная сыворотка) и среде Леффлера (3 части бычьей сыворотки + 1 часть сахарного бульона) дифтерийные коринебактерии развиваются в течение 16 18 ч, рост их напоминает шагреневую кожу, колонии между собой не сливаются.
По культуральным и биологическим свойствам коринебактерии дифтерии подразделяются на три биовара gravis, mitis и intermedius, которые отличаются друг от друга по ряду признаков.
Коринебактерии биовара gravis на теллуритовом агаре, содержащем дефибринированную кровь и теллурит калия, образуют крупные шероховатые (R-формы) розеткообразные колонии черного или серого цвета. Они ферментируют декстрин, крахмал и гликоген, в бульоне образуют поверхностную пленку и зернистый осадок, обычно высокотоксичны и обладают более выраженными инвазионными свойствами.
Коринебактерии биовара mitis на теллуровом агаре растут с образованием темных гладких (S-формы) блестящих колоний. Они не ферментируют крахмал и гликоген, декстрин ферментируют непостоянно, вызывают гемолиз эритроцитов всех видов животных, в бульоне отмечается диффузное помутнение. Культуры этого типа, как правило, менее токсигенны и инвазионны, чем коринебактерии биовара gravis.
Коринебактерии биовара intermedius занимают промежуточное положение. Колонии у них на теллуритовом агаре мелкие (RS-формы), черного цвета, не ферментируют крахмал и гликоген, в бульоне растут с появлением мути и зернистого осадка.
Ферментативные свойства. Дифтерийные коринебактерии (все три биовара) не свертывают молоко, не разлагают мочевину, не выделяют индол, слабо образуют сероводород, восстанавливают нитраты в нитриты, а также теллурит калия в сульфид теллурита, вследствие чего колонии дифтерийных коринебактерии на теллуритовом агаре становятся черными или серыми.
Дифтерийные коринебактерии ферментируют глюкозу и мальтозу, непостоянно галактозу, крахмал, декстрин, глицерин.
Дифтерийные бактерии ферментируют цистеин с образованием сероводорода и не разлагают мочевину, в то время как дифтероида расщепляют мочевину, но не ферментируют цистеин.
Дифтерийные коринебактерии продуцируют бактериоцины (коринецины), наделяющие их некоторыми селективными преимуществами.
Токсинообразование. Дифтерийные коринебактерии продуцируют в бульонных культурах сильные экзотоксины (гистотоксин, дермонекротоксин, гемолизин). Токсигенность коринебактерии дифтерии связана с лизогенностью (наличие в токсигенных штаммах умеренных фагов профагов). Классический международный эталонный штамм Парк-Вильямс 8 продуцент экзотоксина также является лизогенным и более 85 лет сохраняет способность к токсинообразованию. Генетические детерминанты токсигенности (tox + -гены) локализованы в геноме профага, интегрированного с нуклеоидом коринебактерии дифтерии.
В результате лизогенизации нетоксигенные штаммы C. diphtheriae (биовара mitis) превращаются в токсигенные (токсигенная конверсия ).
Дифтерийный токсин – термостабильный полипептид, состоящий из двух фрагментов, названных А и В. Фрагмент B требуется для транспортировки фрагмента А в клетку, где он подавляет элонгацию полипептидной цепи на рибосоме. Подавление синтеза белка, вероятно, обеспечивает оба токсических эффекта дифтерийного токсина некротический и нейтротоксический.
Дифтерийный токсин неустойчив. Он легко разрушается под влиянием температуры, света и кислорода воздуха, но сравнительно резистентен к действию ультразвука.
После добавления к токсину 0,3 0,4 % формалина и последующего выдерживания при 38 – 40 °С в течение 3 4 недель происходит превращение его в дифтерийный анатоксин , который обладает большей устойчивостью по отношению к физическим и химическим воздействиям, чем исходный токсин.
Токсигенные штаммы дифтерийных коринебактерий наряду с лизогенностью характеризуются выраженной дегидрогеназной и нейраминидазной активностью, в то время как нетоксигенные штаммы такой активностью не обладают.
Антигенная структура. Путем реакции агглютинации у возбудителя дифтерии установлено 11 сероваров.
Токсины, образуемые различными штаммами биоваров gravis и mitis, не различаются между собой и полностью нейтрализуются стандартным дифтерийным антитоксином. Рядом авторов установлено наличие у коринебактерии дифтерии вариантоспецифических термолабильных поверхностных белковых антигенов (К-антигенов) и группоспецифических термостабильных соматических полисахаридных антигенов.
Среди коринебактерии дифтерии имеется 19 фаготипов, с помощью которых выявляют источники инфекции; фаготипы учитываются также при идентификации выделенных культур.
Резистентность. Дифтерийные коринебактерии сравнительно устойчивы к вредному влиянию факторов внешней среды. На свернутой сыворотке остаются живыми до 1 года, при комнатной температуре до 2 месяцев, на детских игрушках до нескольких суток. Коринебактерии довольно долго сохраняются в пленках больных дифтерией, особенно если пленки не подвергаются действию света. От действия температуры 60 °С и 1 % раствора фенола коринебактерии погибают в течение 10 мин.
Патогенность для животных. В естественных условиях вирулентные дифтерийные коринебактерии обнаружены у лошадей, коров, собак, инфицированных, вероятно, от людей больных и носителей. Однако домашние животные в качестве источников заражения человека роли не играют
Из лабораторных животных наиболее восприимчивы морские свинки и кролики. При заражении их культурой или токсином у них развивается типичная картина токсикоинфекции с образованием на месте введения воспаления, отека, некроза. Внутренние органы гиперемированы, в надпочечниках наблюдаются кровоизлияния. Доза 0,06 мкг токсина убивает морскую свинку массой в 250 г.
Патогенез заболевания у человека. Источником инфекции являются больные дифтерией и носители. Болезнь передается воздушно-капельным путем, иногда с частицами пыли; передача возможна также через различные предметы (игрушки, посуда, книги, полотенца, платки и т. д.), пищевые продукты (молоко, различные холодные блюда и др.), инфицированные дифтерийными коринебактериями.
В эпидемиологии дифтерии большую роль играют носители. В среднем число носителей из реконвалесцентов и здоровых лиц колеблется в пределах 3 5%.
Наибольшую заболеваемость дифтерией отмечают осенью, что объясняется увеличением скученности детей в это время года и снижением сопротивляемости организма под влиянием охлаждения.
Дифтерийные коринебактерии благодаря наличию у них диффузионного фактора обладают способностью проникать в кровь и ткани больных людей и зараженных животных. Диффузионный фактор представляет собой фермент гиалуронидазу, обладающую способностью расщеплять гиалуроновую кислоту. К факторам инвазионности относятся нейраминидаза, некротический фактор, фибринолизин.
В патогенезе дифтерии ведущую роль играет гистотоксин, который блокирует синтез белка в клетках млекопитающих, инактивирует фермент трансферазу, ответственную за образование полипептидной цепи.
В клинике и эксперименте на животных доказано влияние на развитие болезни патогенных стафилококков и стрептококков, которые в значительной степени усиливают тяжесть инфекции.
У человека на месте внедрения возбудителя дифтерии (зев, нос, трахея, конъюнктива глаз, кожа, вульва влагалища, раневая поверхность) образуются пленки с большим количеством дифтерийных коринебактерии и других микробов. Продуцируемый экзотоксин вызывает некроз и дифтеритическое воспаление слизистых оболочек или кожи, всасываясь, он поражает нервные клетки, сердечную мышцу и паренхиматозные органы, обусловливает явления общей тяжелой интоксикации.
Глубокие изменения происходят в сердечной мышце, сосудах, надпочечниках, а также в центральной и периферической нервной системе. Поэтому выделяют три точки приложения дифтерийного токсина в организме: миокард (развитие токсического дифтерийного миокардита), надпочечники (падение тонуса сосудов и артериального давления из-за снижения выработки адреналина), нервная система (развитие параличей и парезов).
По локализации процесса наиболее часто наблюдаются дифтерия зева и дифтерийный круп (дифтерия гортани), затем дифтерия носа. Сравнительно редко встречается дифтерия глаз, ушей, половых органов, кожи и раны. На дифтерию зева приходится более 90 % всех заболеваний, второе место занимает дифтерия носа.
Смерть от дифтерии гортани может быть из-за асфиксии, удушья, потому что даже небольшая дифтеритическая пленка может полностью перекрыть голосовую щель. При дифтерии зева большинство смертных случаев связано с поражением сердца вследствие интоксикации.
Иммунитет . При дифтерии невосприимчивость зависит главным образом от содержания антитоксина в крови. Нельзя, однако, исключить определенной роли и антибактериального комплекса, связанного с фагоцитозом и наличием опсонинов, агглютининов, преципитинов и комплементсвязывающих веществ. Иммунитет при дифтерии носит антиинфекционный (антитоксический и антибактериальный) характер.
Проба Шика . Наличие противодифтерийного антитоксического иммунитета можно выявить с помощью реакции Шика. 1/40 Dlm токсина для морской свинки в объеме 0,2 мл вводят детям в предплечье внутрикожно. При положительной реакции, свидетельствующей об отсутствии антитоксического иммунитета, на месте введения через 24 48 ч появляются краснота и припухлость диаметром до 2 см. Положительная реакция Шика наступает при отсутствии антитоксина или незначительном количестве его в сыворотке крови. Отрицательная реакция Шика является в известной степени показателем невосприимчивости к дифтерии.
В связи с тем что дифтерийный экзотоксин вызывает состояние сенсибилизации и обусловливает у многих детей развитие тяжелых осложнений, ранее широко применявшаяся реакция Шика используется ограниченно.
Для определения количества антитоксинов в крови рекомендована реакция непрямой гемагглютинации с эритроцитами, сенсибилизированными дифтерийным анатоксином.
Наиболее восприимчивыми к дифтерии являются дети в возрасте 1 4 лет. В последние годы отмечено относительное увеличение заболеваемости среди лиц 15 лет и старше.
Перенесение дифтерии оставляет менее прочный иммунитет, чем при других заболеваниях детского возраста (корь, коклюш). Повторные заболевания дифтерией наблюдаются в 6 - 7% случаев.
Лечение. Терапия дифтерии включает изоляцию больного, строгий постельный режим , раннее назначение антитоксина и соответствующую антибиотикотерпию . Может потребоваться поддерживающая терапия типа зондирования и вентиляции при обструкции дыхательных путей.
Больным дифтерией вводят антитоксическую сыворотку в дозах 5000 - 15000 ME при средней тяжести заболевания и 30 000 50 000 ME при тяжелых формах.
C. diphtheriae чувствительна к пенициллину, тетрациклину, рифампицину и клиндамицину. Эритромицин предпочтительнее пенициллина для лечения дифтерии горла, особенно при лечении носителей. Описаны эритромицин- и тетрциклин-устойчивые штаммы.
Антибиотикотерпия не оказывает никакого влияния на преформированный (ранее образованный) токсин, который быстро распространяется от места повреждения и, если не будет нейтрализован антитоксином, быстро связывается с клетками тканей необратимо.
Лечение) не должна ждать лабораторное подтверждение, если имеется сильное клиническое подозрение, поскольку коэффициент смертности непосредственно связан с периодом задержки перед предоставлением антитоксина, повышение от ноля до 20 % между началом болезни и дня 5 из инфекции, средний случай заболевания - коэффициент смертности - 5-7 %.
Применяют также пенициллин, тетрациклины, рифампицин, клиндамицин, сульфаниламидные препараты и сердечные средства.
Для лечения носителей назначают антибиотики. Хороший результат дает применение тетрациклина, эритромицина в сочетании с витамином С.
Профилактика. Заключается в ранней диагностике, немедленной госпитализации, полноценной дезинфекции помещения и предметов, выявлении носителей.
Специфическую профилактику проводят путем активной иммунизации. Существует несколько вакцин, используемых для специфической профилактики дифтерии: 1) адсорбированный дифтерийный анатоксин (АД-анатоксин); 2) адсорбированный дифтерийно-столбнячный анатоксин (АДС-анатоксин); 3) адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина (АКДС-вакцина). Все эти препараты применяют согласно инструкциям или наставлениям.
Нужно отметить, что не все иммунизируемые дети приобретают резистентность к дифтерии. В среднем 5-10 % из них остается восприимчивыми, или рефрактерными, т.е. неспособными к образованию антител после иммунизации. Такое состояние является результатом иммунологической толерантности, агаммаглобулинемии или гипогаммаглобулинемии.
Ранее дифтерия была грозным заболеванием детей. В России в 1886 - 1912 гг. ежегодно заболевало более 250000 человек. Летальность была очень высокой 12 -30%.
Благодаря введению обязательной иммунизации против дифтерии достигнуты большие успехи в борьбе с этой инфекцией. Заболеваемость дифтерией в 1975 г. по сравнению с 1913 г. снизилась до единичных случаев, смертность от дифтерии уменьшилась более чем в 100 раз.
Однако, в настоящее время дифтерия вновь стала актуальной инфекцией для стран бывшего СССР, в том числе и для Украины.