Симптомы микоза стоп. Лабораторная диагностика микозов * my dermatology Диагностика грибковых заболеваний

Согласно инструкции СП 1.2.036-95 Госкомэпиднадзора РФ, Москва, 1996 г. "Порядок учета, хранения, передачи и транспортирования микроорганизмов I-IV групп патогенности” по эпидемиологической опасности дрожжевые и плесневые грибы, а также дерматофиты относятся к III-IV группам возбудителей инфекционных болезней, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать особые правила техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены, направленные на обеспечение личной и общественной профилактики заражения, аллергизации и распространения инфекции.

Лаборатория для работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности укомплектовывается легко дезинфицирующейся мебелью, включая шкафы для чистой лабораторной посуды, реактивов, питательных сред, соответствующим оборудованием и инструментами. Для работы необходимы спиртовки или газовые горелки, микробиологические петли, микологические лопаточки, шпатели, эпиляционные и анатомические пинцеты, кусачки маникюрные, скальпели, ножницы, ложечки Фолькмана, пипетки, пастеровские пипетки, иглы препаровальные, стеклянные палочки, шприцы, низкоскоростная центрифуга, аппарат для встряхивания, чашки Петри, пробирки, стеклянная посуда, ультрафиолетовая лампа Вуда с фильтром, микроскопы, осветители, термостаты, автоклавы, холодильники, сухожаровые шкафы, бактерицидные лампы.

Взятие материала для исследования

Микроскопическая диагностика микозов подразумевает обнаружение мицелия и спор в исследуемом биоматериале. В качестве исследуемого биоматериала рассматриваются чешуйки эпидермиса, волосы и ногти. Непременным требованием перед проведением исследования является отсутствие местного лечения в течение, как минимум, десяти дней и системного лечения – в течение месяца. Следует иметь в виду, что использование пациентом моющих средств (особенно содержащих антисептики) способно повлиять на достоверность результатов исследования, поэтому за 3-4 дня до его проведения запрещают мытьё.

Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата представлен на рисунке:

Фото. Инструментарий для взятия биоматериала и приготовления препарата.

При подозрении на микоз гладкой кожи, микоз кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса с поверхности очага поражения. При микозе гладкой кожи является предпочтительным исследование эпидермиса с краевой зоны очага поражения, так как в центральной зоне патологический процесс нередко разрешается. При этом не следует забывать о возможности поражения пушковых волос, что определяет выбор дальнейшей тактики лечения. Волосы извлекают эпиляционным пинцетом. При микозе кистей и стоп без поражения ногтевых пластинок исследуются чешуйки эпидермиса из третьей и четвертой межпальцевых складок, а также с ладоней и со свода стоп.

При подозрении на грибковое поражение длинных волос (волосистой части головы, бороды, усов и лобка), а также пушковых волос выполняется их микроскопическое исследование. При трихофитии волосистой части головы волосы обламываются на расстоянии 1-2 мм над уровнем устья волосяного фолликула, напоминая при этом пеньки и точки. Если волос не удаётся захватить эпиляционным пинцетом, то в этом случае его стараются извлечь острым концом скальпеля или препаровальной иглой.

При микроспории волосистой части головы волосы обламываются на высоте 5-6 мм, напоминая «скошенный луг». При микроскопии исследуются именно эти обломанные волосы. Волосы из очагов поражения извлекают с помощью пинцета.

При фавусе исследуют истончённые волосы над поверхностью скутулы.

При подозрении на онихомикоз исследуется легко измельчающийся материал из зоны подногтевого гиперкератоза, а также сами измененные ногтевые пластинки.

Необходимо понимать, что любой исследуемый материал от пациента потенциально заразен, поэтому его взятие необходимо осуществлять в помещении, где осуществляется ежедневная влажная уборка с применением дезинфицирующих средств (5% раствор хлорамина, 5% осветленная хлорная известь), а воздух стерилизуется ультрафиолетовыми облучателями (их включают на 1-1,5 ч и входят в помещение через 20 мин после выключения). Термостаты еженедельно протирают 0,5% раствором хлорамина, стены обрабатывают дезсредствами 1 раз в месяц. Врач при работе должен быть защищён маской, защитными очками, халатом и перчатками. Инструментарий для взятия биоматериала, перчатки, предметные и покровные стёкла, одноразовые пелерины и салфетки обеззараживают после использования, погружая в 1,5% раствор клиндезина-экстра (5% раствор фенола или 5% раствор лизола) на 30 минут. Оставшийся патологический материал (волосы, кожные и ногтевые чешуйки) автоклавируют при 2 атм. и 132˚ С в течение 20 мин (контроль - мочевина) или при 1,5 атм. и 126˚ С в течение 30 мин (контроль - бензойная кислота), либо кипятят 1 час в воде или 30 мин в 1% мыльно-содовом растворе.

Патологический материал транспортируют в лабораторию в специальной таре или металлических биксах, защищая его от прямых солнечных лучей. В сопроводительном документе указывают фамилию, имя, отчество, пол, возраст и адрес больного, предполагаемый клинический диагноз, наименование исследуемого материала, время его взятия, локализацию очага, номер истории болезни, фамилию врача и учреждение, направляющее материал.

Приготовление препарата

После получения чешуек эпидермиса с очага поражения производится приготовление препарата для микроскопического исследования. На исследуемый материал, помещенный на предметное стекло, наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии. Затем препарат накрывают покровным стеклом (которое придавливают препаровальной иглой) и микроскопируют. Исследование необходимо проводить не позднее 2-х часов после приготовления препарата из-за возможности кристаллизации щёлочи.

Способ приготовления препарата волоса при подозрении на его грибковое поражение соответствует ранее описанному, с той лишь разницей, что покровное стекло не придавливается препаровальной иглой (во избежание раздавливания волоса).

Фото. Появление ободка кристаллизованной щелочи.

Для приготовления препарата кусочки срезанных ногтевых пластинок опускают в пробирку с 20% КОН и экспонируют в термостате в течение 1 часа (t≈37˚C), а затем получившуюся желеобразную массу переносят на предметное стекло, накрывают покровным и исследуют под микроскопом.

В отличие от ногтевых пластинок образцы из легко измельчающегося материала зоны подногтевого гиперкератоза помещают на предметное стекло, на них наносят 1-2 капли 20% КОН, после чего предметное стекло подогревают над пламенем горелки до появления белесоватого ободка кристаллизованной щелочи по периферии (рис.65). Затем препарат накрывают покровным стеклом, которое осторожно придавливают препаровальной иглой, и исследуют под микроскопом.

Микроскопия препарата

Для проведения микроскопического исследования используют лабораторный микроскоп без применения иммерсии. Микроскопия чешуек эпидермиса, чешуек из зоны подногтевого гиперкератоза, а также растворенных ногтевых пластинок производится вначале на малом увеличении (×100), а при обнаружении нитей мицелия, напоминающих «карту рек» (железных дорог), объектив переводится на бȯльшее увеличение (×400). Мицелий на среднем увеличении напоминает причудливой формы стеклянные палочки, изменяющие степень преломления света при работе микровинтом микроскопа.

Микроскопия препарата волоса производится сразу на среднем увеличении (×200 или ×400). При трихофитии внутри волоса обнаруживаются крупные споры, расположенные рядами, тогда как при микроспории внутри волоса имеется множество мелких мозаично расположенных спор (отсюда термин «микроспория»). Иногда отмечают наличие чехлика снаружи волоса – это характерно для как трихофитии (вариант ectothrix, споры при этом крупные), так и для микроспории (в этом случае чехлик состоит из мелких спор). При микроскопии пораженных волос при фавусе, внутри волоса кроме скоплений спор круглой или многоугольной формы, обнаруживаются пузырьки воздуха и нити мицелия.

Препараты необходимо просмотреть не позднее 2 часов с момента их приготовления из-за возможности кристаллизации щелочи. Для повышения надежности диагностики следует сделать несколько препаратов (не менее двух) из одного очага поражения. Возможные ошибки при микроскопической диагностике микозов могут быть связаны как с некачественным приготовлением препаратов (перегревом над пламенем горелки, что сопровождается преждевременной кристаллизацией щелочи), а также с недостаточным опытом исследователя (когда за нити мицелия нередко принимают волокна ткани, случайно оказавшейся в препарате).

Клиническая картина грибковых заболеваний кожи весьма полиморфна, поэтому во всех случаях диагноз должен быть подтвержден лабораторными методами исследования. Для лабораторной диагностики микозов используют микроскопический, люминесцентный, культуральный, иммунологический (аллергологический и серологический) методы исследования, а также эксперименты на животных.

Лабораторная диагностика микозов складывается из нескольких этапов. В обычной клинической практике обычно ограничиваются микроскопическим и культуральным исследованием зараженного материала. При необходимости эти методы дополняются иммунологическими, гистологическими исследованиями, заражением экспериментальных животных. При некоторых микозах кожи важную вспомогательную роль в диагностике играет люминесцентный метод.

Взятие патологического материала.

Успех лабораторного исследования микозов во многом зависит от правильного взятия патологического материала. Поскольку грибы способны поражать различные органы человека, при подозрении на микоз необходимо исследовать различный патологический материл. В дерматологической практике чаще всего приходится иметь дело с микозами, при которых исследованию на грибы подлежат кожные чешуйки, волосы, ногти. При подозрении на глубокие и системные микозы может возникнуть необходимость лабораторной диагностики на грибы мокроты, промывных вод, мочи, фекалий, гноя, отделяемого слизистых оболочек, крови, кусочков органов и биопсированной ткани.

В очагах поражения на коже, из которых предполагается брать патологический материал, за несколько дней или недель необходимо прекратить всякое лечение. Следует иметь в виду, что использование слабых дезинфицирующих растворов или даже индифферентных средств может помешать исследованию. Непосредственно перед забором патологического материала очаг поражения необходимо обработать 96% спиртом или раствором ксилола. Материал лучше всего брать со свежих, но уже полностью развившихся очагов поражения. Кожные чешуйки необходимо соскабливать с периферии очагов, грибы здесь встречаются чаще всего как в виде мицелия, так и спор. Кожные чешуйки снимаются скальпелем, корочки - эпиляционным пинцетом.

У больных микозами волосистой части головы пораженные волосы извлекают эпиляционным пинцетом. Для исследования необходимо брать короткие, перекрученные, изогнутые в виде дуги или запятой, а также длинные, но покрытые чехлом в основании, волосы. При подозрении на фавус необходимо помнить о том, что волосы не обламываются, но становятся тусклыми, безжизненными, седоватыми.

Соскобы с поверхностных очагов пораженных ногтевых пластинок делают скальпелем, утолщенные ногтевые пластинки срезают скальпелем или маникюрными кусачками.

Жидкий патологический материал собирают асептично в стерильную посуду, чешуйки кожи, ногтя и волосы – на листочки простой или мягкой пергаментной бумаги.

Отделяемое со слизистых оболочек для посева берут тампоном из гигроскопической ваты, который затем помещают в сухую стерильную пробирку или пробирку с 2 мл питательной среды (сусло Сабуро). Материал из влагалища получают из заднего свода; с головки полового члена – из области венечной борозды.

Материал из наружного слухового прохода берут петлей или тампоном, который помещают в пробирку.

Поступивший в лабораторию материал исследуют в течение 1 ч после взятия при хранении в условиях комнатной температуры или не более чем через 3 ч при хранении в холодильнике при температуре 4 °С.

Кровь для исследования на грибы берут из локтевой вены в количестве 5 – 10 мл и вносят сразу с колбочку с жидкой питательной средой или равным количеством цитрата натрия.

При необходимости исследования на грибы биопсийного материала его помещают в стерильную чашечку Петри и используют для микроскопии, посевов на питательные среды и приготовления гистологических препаратов.

Микроскопическое исследование.

Микроскопическое исследование патологического материала на грибы производят в нативных и окрашенных препаратах. Для приготовления неокрашенных препаратов полученный материал размельчают при помощи скальпеля или препаровальной иглы и помещают на середину предметного стекла. Для более четкого выявления элементов гриба производят просветление (мацерацию) материала. С этой целью прибегают к помощи различных веществ, чаще всего едкой щелочи (КОН, NaOH), которые растворяют эпидермальные чешуйки, слизь, гной, просветляют пигмент волоса и тем самым делают грибы доступными для исследования.

В некоторых лабораториях просветление препаратов для микроскопического исследования проводят 15 - 30% раствором КОН, в который добавляют 5 - 10% коммерческих темно-синих чернил фирмы Паркер (Parker"sSuperchromeBlue-BlackInk). При этой окраске гифы и споры окрашиваются в голубой цвет.

2. Лабораторное исследование патологического материала

2.1. Микроскопические исследования

Для обнаружения морфологических элементов гриба - дрожжевых клеток, псевдомицелия, мицелия, конидиеносцев, конидий, тканевых форм глубоких микозов - патологический материал исследуют в нативных и окрашенных препаратах.

Жидкий патологический материал просматривают в неокрашенном состоянии в следующих просветляющих жидкостях: смесь спирта с глицерином (этиловый спирт 1 ч., глицерин 2 ч., дистиллированная вода 2 ч.), раствор Люголя (1 г кристаллического йода, 2 г калия йодида, 150 мл воды), а также в воде или физиологическом растворе. Для приготовления нативных препаратов на предметное стекло петлей или пипеткой наносят каплю материала, затем 1-2 капли просветляющей жидкости, накрывают покровным стеклом и микроскопируют при малом увеличении 1:80 (окуляр 10х и объектив 8х), при котором можно видеть скопления дрожжевых клеток, псевдомицелий, мицелий и другие элементы грибов. При большом увеличении 1:400, можно характеризовать отдельные клетки.

Плотный патологический материал (кожные, ногтевые чешуйки) помещают в каплю 10-20% раствора КОН, слегка подогревают над пламенем горелки (для лучшей мацерации) до появления кристалликов щелочи по периферии капли. Затем каплю накрывают покровным стеклом, слегка надавливают на него и микроскопируют, вначале под малым увеличением для нахождения чешуйки, далее при большом увеличении.

В материале из волос мантия из окружающих волос спор (эктотрикс) или внутри волоса (эндотрикс) элементы гриба обычно очень четко видны. Поражения волос, как и размеры спор, специфичны для различных видов дерматофитов. Необходима дифференциальная диагностика между структурами гриба и артефактами. Возможными источниками ложноположительных результатов являются липидные капли, пузырьки воздуха, волокна текстиля и так называемый “мозаичный гриб”. Липидные капли могут быть похожи на дрожжевые клетки – такие находки наиболее часты в плохо просветленном материале. Волокна текстиля обычно лежат отдельно от материала эпидермиса, волос или ногтя. Они крупнее, чем гифы гриба, неравномерной толщины и не содержат септ. “Мозаичный гриб” – это артефакт, полученный в процессе кристаллизации КОН при чрезмерном нагревании препаратов. В отличие от грибов, четких разделений на клетки не определяется.

Важным этапом диагностики грибковых инфекций является приготовление окрашенных препаратов. Любой патологический материал (мазковые препараты, отпечатки органов, центрифугаты и, конечно, гистологические срезы) должны пройти три основных вида обработки: 1) окраска PAS-методом для выявления истинных грибов – эумицетов; 2) окраска по методу Грама или в модификациях по Грам-Вайгерту, по Боголепову, по Браун-Бренна – для выявления сопутствующей бактериальной микробиоты, для выявления актиномицетов и нокардий; 3) окраска по методу Циль-Нильсона или модификация по методу Киньона – для выявления кислотоупорных микроорганизмов, прежде всего, для индикации и дифференцировки с микобактериями туберкулеза, для обнаружения возбудителей проказы, нокардий и спорообразующих дрожжей.

PAS-метод (Шифф-йодная кислота) предполагает выявление в стенках микроорганизмов нейтральных полисахаридов. В стенках большинства эумицетов имеется в той или иной концентрации глюкан-маннановый комплекс, за счет чего и происходит окрашивание.

Прокариоты (бактерии) оказываются РАS–отрицательными, в том числе интересующие миколога актиномицеты и нокардии. Однако при формировании актиномикотических друз образуется так называемый “цемент”, склеивающий вегетирующий актиномикотический мицелий в гранулу, который также дает РАS-положительную окраску. В связи с чем, этот метод применим и при диагностике актиномикоза.

РАS-реакция (и ее модификация) является важнейшим методом диагностики тканевых форм грибковой инфекции. Метод основан на окислении гликолиевых групп углеводов йодной или хромовой кислотой. Йодная кислота окисляет 1,2 и 1,4 гликоли в альдегиды и разъединяет связи между носящими гидроксильные группы углеродными атомами. Альдегидные группы могут быть обнаружены и при помощи альдегидного реактива Шиффа. In situ в стенках гриба происходит интенсивное окрашивание гетерополисахаридного комплекса в пурпурно-красный цвет (методика – см. приложения).

Для подавления окраски окружающих тканей применяется обработка (“контрокраска”) световым зеленым, метаниловым желтым и т.п. В этом случае выявляются только грибные клетки, что весьма полезно на стадии индикации возбудителя в тканях или в мазковых препаратах. В то же время, судить об ответной реакции организма и альтерации тканей на таких препаратах не представляется возможным. Всегда необходимо иметь параллельные препараты, окрашенные РАS-методом с докраской гематоксилином.

На практике применяется не только РАS-метод в классическом варианте, но и его различные модификации: окисление хромовой кислотой (вместо йодной) – это реакция Бауэра, окраска по Гридли, импрегнация метенаминсеребром по методу Гомори-Грокотт. Все они успешно используются для обнаружения тканевых форм грибов, и в основе их лежит один и тот же принцип (техника – см.приложение). Табл.3.

Таблица 3

Тинкториальные свойства тканевых форм грибов

(в патологическом материале, в гистологических срезах)

Оппортунистические микозы	Методы выявления
Кандидоз	РАS или окраска по методу Гридли
Аспергиллез	Гематоксилин и эозин, импрегнация по Гомори-Грокотт
Зигомикоз	Гематоксилин и эозин
Криптококкоз	Альциановый синий (по методу Моури) + РАS-реакция + гематоксилин
Пневмоцистоз	Окраска по методу Бауэра, импрегнация по Гомори-Грокотт, окраска тионином
Фузариоз	Окраска по методу Романовского-Гимзы, по методу Райта
Сцедоспориоз
Трихоспороз	Гематоксилин и эозин, окраска по методу Романовского-Гимзы
Феогифомикозы и хромомикоз	Гематоксилин и эозин
Первично-патогенные микозы:	Методы выявления
Кокцидиоидоз	РАS –реакция + гематоксилин
Гистоплазмоз	импрегнация по Гомори-Грокотт, окраска по методу Бауэра, окраска по методу Романовского-Гимзы
Североамериканский бластомикоз
Паракокцидиодоз	РАS –реакция, импрегнация по Гомори-Грокотт
Адиаспиромикоз	Гематоксилин и эозин, РАS-реакция
Псевдомикозы:	Методы выявления
Актиномикоз	Гематоксилин и эозин, окраска по методу Грам-Вейгерту
Нокардиоз	окраска по методу Циль-Нильсена, по методу Киньона, по методу Грама.

При предположении диагноза “криптококкоз” целесообразно применять методы специфического выявления капсульного материала Cr.neoformans , содержащего гликозаминогликаны (кислые полисахариды). Для этой цели используется окраска альциановым синим (по методу Моури), основным коричневым (по методу Шубича), окраска муцикармином. Очень полезна тройная окраска: РАS-реакция, затем обработка альциановым синим, затем гематоксилином. В этом случае становится возможной дифференцировка между криптококками и тканевыми формами других грибов, имеющих сходную морфологию.

Описание патологического материала (гистологических препаратов) включает данные о морфологии и размерах тканевых форм грибов, их тинкториальной характеристике, отношении к тканям хозяина, наличии фагоцитоза, определении сопутствующей микробиоты.

2.2. Посев патологического материала и количественный учет клеток при микозах, вызванных дрожжевыми грибами

Получение культур грибов необходимо для их идентификации и определения чувствительности к антифунгальным препаратам.

МОКРОТУ перед исследованием 5-10 мин гомогенизируют встряхиванием со стерильными бусами. Если мокрота содержит много слизи и плохо гомогенизируется, к ней можно добавить 1-2 мл стерильного физиологического раствора. Мокроту микроскопируют в нативных или окрашенных препаратах. Если при микроскопии мокроты с большим увеличением в поле зрения видны элементы гриба, то ее следует сеять в разведениях 1:10, 1:100, 1:1000, если элементы гриба не обнаруживаются, мокроту сеют не разведенную. Разведения готовят в жидкой питательной среде (сусло, Сабуро, 1% пептонная вода) или в стерильном физиологическом растворе. Из каждого разведения посев производят по 0,1 мл с помощью шпателя на 2 чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА с добавлением антибактериальных антибиотиков – пенициллина и стрептомицина, биомицина (100-200 ед./мл среды). Питательную среду предварительно подсушивают в термостате при +37 С, т.к. при наличии конденсата рост колоний может иметь сливной характер. Посевы инкубируют в термостате при + 37 о С в течение 48 ч. Затем при наличии роста однотипных дрожжевых колоний производят их количественный учет. Расчет численности дрожжевых клеток (n) в 1 мл или 1 г исследуемого материала производят по формуле n = авс, где а - среднее число колоний на одной чашке Петри, в = 10 при объеме посевного материала 0,1 мл, с- степень разведения экскрета (10,100,1000).

Пример расчета: на чашках с разведением 1:1000 выросло в среднем 60 колоний, при этом в 1 мл исследуемого экскрета содержится 60 х 10 х 1000=600000 дрожжевых клеток.

БАЛ, ПРОМЫВНАЯ жидкость бронхов, гайморовых полостей, желчь (порции А,В,С), желудочный сок, дуоденальное содержимое, мочу переносят в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10-15 мин, после чего надосадочную жидкость быстрым движением сливают. Из осадка готовят нативные препараты для микроскопии. Если при микроскопии дрожжевые клетки обнаруживаются в каждом поле зрения, то посев производят в разведениях 1:100 и 1:1000 по 0,1 мл на плотные питательные среды и инкубируют при 37 С 48 ч. Если при микроскопии осадка дрожжевые клетки не обнаруживаются, осадок засевают без разведения. Количество дрожжевой флоры рассчитывают на 1 мл патологического материала.

ФЕКАЛИИ забирают мерной ложкой в количестве 0,2 г, помещают в1,8 мл жидкого сусла и тщательно размешивают стеклянной палочкой. Полученное разведение (1:10) отстаивают 5-10 мин, готовят разведения 1:100, 1:1000 и засевают в объеме 0,1 мл на 2 чашки Петри с агаризованной средой. Учет количества дрожжевой флоры производят на 1 г фекалий.

ЦЕРЕБРОСПИНАЛЬНАЯ жидкость. Характеризуют ее внешний вид (прозрачная или мутная, бесцветная или окрашенная, наличие примеси крови, осадка). Микроскопируют мазки из осадка ликвора после его центрифугирования. Готовят три препарата: нативный - в капле стерильного физиологического раствора: нативный - в капле туши и мазок для окраски РАS-методом, по Граму и альциановым синим по Моури.

Микроскопия цереброспинальной жидкости в нативных и окрашенных препаратах позволяет установить наличие дрожжевых почкующихся клеток и фрагментов мицелия гриба, либо бактерий, вызывающих гнойный менингит (менингококк, пневмококк, гемофильная палочка и др.). В тушевом препарате может быть выявлен капсульный гриб Cryptococcus neoformans. При этом на сером фоне туши видны почкующиеся дрожжевые клетки, окруженные светлым ореолом капсулы. В тушевых препаратах также могут быть дрожжевые формы Candida albicans , не имеющие светлого ореола капсулы вокруг клетки.

Cr. neoformans может быть также обнаружен с помощью окраски альциановым синим (по Моури). Окраска происходит за счет селективного выявления капсульного гетерополисахарида характерного для Cr.neoformans . При обнаружении в окрашенном по Граму препарате бактериальной флоры дальнейшее исследование цереброспинальной жидкости проводят по соответствующим бактериологическим методикам. После микроскопии осадка производят посев жидкости на 3 чашки свежеприготовленных, подсушенных сусло-агара или агара Сабуро, а также на жидкое сусло или жидкую среду Сабуро. На поверхность питательного агара чашек 1 и 2 наносят 2-3 капли осадка жидкости и тщательно втирают шпателем, а на поверхность агара чашки 3 для обнаружения мицелиальных грибов производят посев по 1 капле в трех точках. Оставшуюся жидкость переносят в 5 мл жидкого сусла или агар Сабуро. Посевы инкубируют при двух температурных режимах: чашку 1 - при +37 о С, а чашки 2 и 3 и посев на жидкой среде - при +28 о С - +30 о С. Посевы при температуре +37 о С просматривают на 2 и 5 день, а при 28 - 30 о С - на 4,7,10 день роста. Если на 5 день при температуре +37 о С и на 10 день при температуре 28-30 о С рост не отмечается, производят высев из жидкой питательной среды на чашки с сусло или агаром Сабуро. В случае отсутствия роста дрожжевой флоры результат посева жидкости регистрируют как отрицательный.

ОТДЕЛЯЕМОЕ свищей. Исследование начинают с микроскопии материала в нативных или окрашенных препаратах. Затем производят посев материала на агаровую среду (сусло или Сабуро), для чего на чашку наносят 2-3 капли отделяемого и шпателем распределяют по поверхности агара. Посевы инкубируют в течение 48 ч при +З7 о С.

ОТДЕЛЯЕМОЕ слизистых.

1. Тампон помещают в пробирку с 2 мл жидкой среды (сусло, Среда Сабуро или МПБ) и встряхивают 5-7 мин, не замочив пробку. Готовят разведения 1:10, 1:100 и высевают по 0,1 мл из каждого разведения на две чашки сусло-агара, агара Сабуро или МПА. Посевы на плотных средах и пробирку с жидкой средой с тампоном (для обогащения) инкубируют при температуре +37 С. Через 48 ч подсчитывают число колоний и ориентировочно определяют количество дрожжевых клеток, взятых тампоном. Для этого количество выросших дрожжевых колоний умножают на 20 и на разведение. При отсутствии роста колоний на чашках из взятых разведений производят повторный высев из среды обогащения на одну чашку с сусло-агаром.

2. Посев можно делать, проводя тампоном с вращением по поверхности питательной среды. При этом количество дрожжевых колоний не учитывают, а отмечают только наличие и интенсивность роста: единичные колонии, значительный или сплошной рост, отсутствие роста микробиоты.

КРОВЬ. Пробы венозной крови для получения гемокультуры необходимо разбавлять средой обогащения, по крайней мере, 1:5 для того, чтобы бактерицидные свойства крови не ингибировали рост грибов. Засевают 5-10 мл свежевзятой крови соответственно в 50-100 мл питательной среды (жидкое Сабуро с 2% глюкозы или в среду Китт-Тароцци после ее регенерации). Для посева можно брать кровь с антикоагулянтом (1:10 5% раствора натрия цитрата). Посевы выращивают 10 дней при +37 о С с контрольным высевом на 5 и 10 дни. Стерильной пипеткой берут осадок, 3 капли которого рассевают бактериологической петлей по поверхности сусло-агара в чашки Петри. Засеянные чашки помещают в термостат с температурой +37 о С на 2-5 суток. В случае роста дрожжевой флоры выдают предварительный ответ о наличии гриба в крови, а культуру определяют до рода и вида.

Описан другой метод посева крови на микофлору (H.Rieth). В этом случае посев 5-10 мл крови производят каплями. На поверхность плотной питательной среды в чашке Петри стерильной пипеткой наносят 40-50 капель крови, на расстоянии 0,5 см между каплями. Посев производят на две чашки Петри, инкубируя в одной чашке при температуре +37 о С, а в другой - при комнатной температуре в течение 2-5 дней.

КУСОЧКИ тканей органов. Делают отпечаток исследуемым кусочком ткани на поверхности плотной питательной среды в чашке Петри, затем производят рассев петлей. Этот же кусочек ткани помещают в 50 мл жидкой питательной среды (сусло, среда Сабуро). Посевы инкубируют в термостате при температуре +37 о С в течение 5 дней.

КОЖНЫЕ и ногтевые чешуйки. Посев чешуек производят независимо от результатов микроскопии. Для этого стерильной микологической лопаточкой, увлажненной в конденсате среды, чешуйки переносят в пробирку на скошенный сусло-агар в 2-3 точки, прижимая их к поверхности среды. В зависимости от количества материала, поступившего на исследование, посев делают в 2-3 пробирки. Посевы инкубируют в термостате при температуре 28-37 о С до 5 дней.

Широко применяются методы быстрой идентификации C.albicans . Этот вид способен образовывать ростковые трубки и короткие нити псевдомицелия в течение нескольких часов (2-4 часа при 37 о С) на сыворотке крови, яичном белке, на среде Игла, на 199 среде и т.п. Практически в лабораториях используется сыворотка человека (остатки от серологических реакций), где при 37 о С образуются ростковые трубки, а через 24 часа клубки псевдомицелия. Для вида C.albicans этот феномен характерен в 90% случаев. Реже образуются ростки у C.tropicalis.

2.3. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при подозрении микозов, вызванных плесневыми грибами

Патологический материал может исследоваться в нативных и окрашенных препаратах. Предметные и покровные стекла, предназначенные для приготовления микропрепаратов, должны храниться в смеси спирта с эфиром (1:1) во избежание загрязнения микобиотой воздуха. Перед употреблением предметные и покровные стекла стерилизуют над пламенем горелки.

Микроскопия материала

МИКРОСКОПИЯ мокроты. Для приготовления нативных препаратов мокроту переносят в стерильную чашку Петри и рассматривают на черном фоне для обнаружения мелких частиц (комочков). Комочки могут быть гнойные, гнойно-слизистые, гнойно-кровянистые. Размеры комочков варьируют по величине в пределах 0,3-3 мм в диаметре, цвет их может быть серым, желтоватым, зеленоватым. Для приготовления нативных микропрепаратов отдельные комочки переносят препаравальными иглами или бактериологической петлей в каплю спирта с глицерином, либо в каплю 10% раствора КОН. Накрывают покровным стеклом, слабо надавливают препаровальной иглой и микроскопируют при малом (1:80, окуляр 10 х и объектив 8х) и большом (1:400, окуляр 10х и объектив 40х) увеличениях микроскопа.

Препараты из промывных вод, экссудата, а также желчи, мочи, желудочного сока, ликвора готовят из нативного осадка или из осадка, полученного в результате центрифугирования (при 1500 об/мин в течение 5 мин). Осадок петлей или пастеровской пипеткой переносят в каплю 10% раствора КОН на предметное стекло, накрывают покровным стеклом и рассматривают при малом и большом увеличениях микроскопа.

Для приготовления окрашенных препаратов исследуемые комочки или каплю осадка равномерно распределяют препаравальными иглами или предметным стеклом меньшего размера по поверхности стерильного предметного стекла до получения тонкого мазка. Полученный мазок подсушивают на воздухе, фиксируют метиловым спиртом или смесью Никифорова (равные части 96% этилового спирта и эфира) в течение 3-5 мин, либо троекратным фламбированием над пламенем горелки. Фиксированный мазок окрашивают по Граму, РАS-методом, калькофлюором белым. Окрашенный препарат микроскопируют с использованием иммерсионной системы микроскопа (1:900, окуляр 10х, объектив 90х).

Посев материала

При исследовании любого патологического материала на мицелиальные грибы его засевают на плотную среду Сабуро или сусло с добавлением пенициллина и стрептомицина (100-200 ед./мл среды). Посев производят в двух повторениях, учитывая различные температурные режимы выращивания мицелиальных грибов (+37 о С и +28 о С), всегда в 3 точки в центре чашки. Время инкубации 4-5 суток.

Мокроту (отобранные комочки) переносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой на поверхность среды Сабуро или сусла. Место посева отмечают карандашом с обратной стороны дна чашки Петри. Засеянные чашки Петри помещают в термостат крышкой вверх.

После определенного срока инкубации засеянные чашки просматривают и при обнаружении спороношения определяют культуру гриба. В случае отсутствия спороношения гриб пересевают на дифференциальную среду Чапека для дальнейшей идентификации.

Осадок промывных вод бронхов, гайморовых полостей, экссудата, мочи, желудочного сока (нативный или после центрифугирования) забирают пипеткой и засевают в объеме 0,1 мл. Фекалии разводят 1:10 (1г фекалий и 9 мл жидкости) в жидкой среде Сабуро или жидком стерильном изотоническом растворе хлорида натрия, эмульгируют, отстаивают 10 мин для осаждения крупных частиц, засевают надосадочную жидкость в объеме 0,1 мл. Отделяемое наружного слухового прохода и зева, взятое тампоном, сеют, тщательно проводя каждой стороной тампона по поверхности питательной среды. Можно засевать смывы с тампонов. Для этого тампоны помещают в 10 мл жидкой среды Сабуро или жидкого сусла со стеклянными бусами и эмульгируют 10 мин, засевают 0,1 мл смыва с тампона газоном (по Лещенко В.М., 1973), либо в три точки.

Кожные и ногтевые чешуйки помещают на поверхность питательной среды, тщательно прижимая их.

Осадок цереброспинальной жидкости (центрифугат при 1500 об/мин в течение 5 мин) сеют на две чашки среды по 0,1 мл, а его остаток засевают в среду обогащения (жидкая среда Сабуро или жидкое сусло), разлитую по пробиркам в объеме 5 мл. Засеянные чашки инкубируют как обычно, а пробирки с посевом на среде обогащения - при + 28 С в течение 10 дней.

В случае наличия роста мицелиального гриба на плотных средах культуру его определяют из этого посева, при отсутствии роста на Сабуро-агаре или сусло-агаре гриб изучают со среды обогащения. Для этого культуру гриба пересевают еще раз на дифференциальную плотную среду Чапека и в дальнейшем идентифицируют.

Из кусочка ткани органа (биопсия, аутопсия) делают отпечаток на поверхность плотной среды надрезанной стороной исследуемого кусочка в трех точках. Одновременно кусочки тканей помещают в 50 мл жидкой питательной среды (Сабуро, сусло).

Кровь исследуют при подозрении на фунгемию в двух - трех повторах. Засевают 5 или 10 мл крови, соответственно в 50 или 100 мл жидкой среды Сабуро с 2 % глюкозы. Посевы выращивают при +37 С и +28 С в течение 10 дней. Первый просмотр посевов проводят через 5 дней, второй - через 10 дней. На пятые сутки можно наблюдать рост мицелиального гриба в виде войлочного комочка на дне и поверхностной пленки. Грибницу пересевают на дифференциальную среду Чапека для определения рода и вида гриба. Если на 5 день рост гриба не отмечается, посевы выдерживают до 10 дней и при отсутствии роста результаты исследования регистрируют как отрицательные.

При посеве на три точки рост гриба в двух и трех точках определяется как диагностически значимый, в одной точке - случайный. При необходимости, возможен повторный посев.

Идентификация выделенных культур плесневых грибов

После выделения культуры мицелиальные грибы пересевают на дифференциальную среду Чапека для родового и, по возможности, видового определения.

В практике диагностических лабораторий, как правило, используют культурально-морфологические критерии идентификации: оценивают характер роста культуры гриба на агаровых средах (культуральная диагностика, макроморфология) и микроморфологию гриба.

В затруднительных случаях используют дополнительные методы диагностики (изучение ферментативной активности, температурных особенностей роста некоторых плесневых грибов).

Понятие макроморфологии (культуральные признаки) включает структуру колонии (пушистая, войлочная, бархатистая, паутинистая, шерстистая, клочковатая, мучнистая и др.), поверхность (плоская, складчатая, бугристая, куполообразная, коремиеформная, зональная и др.), пигментацию колонии гриба и субстрата (различные оттенки зеленого, голубого, фиолетового, черного, серого и др.), наличие экссудата на поверхности колонии.

Микроморфологию гриба из культуры изучают по препаратам, которые в зависимости от родовой принадлежности гриба готовят следующим образом: на предметное стекло наносят каплю жидкости для приготовления препаратов (равные части спирта, глицерина и воды); в нее помещают кусочек грибницы, вырезанной микологической лопаточкой из колонии в виде треугольника с захватом центральной и периферической частей, двумя препаровальными иглами расправляют вырезанный кусочек с осторожностью во избежание образования пузырей воздуха. В некоторых случаях (мукор и ризопус) при приготовлении препарата грибницу расправляют на сухом предметном стекле, на нее наносят каплю жидкости и накрывают покровным стеклом. Препараты просматривают под микроскопом при малом и большом увеличениях. Изучают субстратный и воздушный мицелий, отмечают наличие или отсутствие септ (перегородок), обращают внимание на характер спороношения: конидиеносцы с конидиями и спорангии со спорангиеспорами.

Конидиеносцы различны по своему строению: от простых одиночных спороносных гиф до ветвистых древовидных образований. Конидиеносцы располагаются поодиночке либо группами, они заметно отличаются от вегетативных гиф мицелия, бесцветные или окрашенные, приподнимающиеся, прямостоящие, ниспадающие, стелющиеся. Они могут состоять из одной клетки и из большого количества разных по форме и величине клеток, каждая из которых имеет свое наименование. Например, у рода Aspergillus конидиеносец состоит из следующих клеток: ножки, пузыревидного вздутия, стеригм, цепочек конидий. У рода Penicillium конидиеносец имеет форму простых или сложных кисточек, состоящих также из различных клеток: веточек-рами, метул, фиалид, цепочек конидий.

У плесневых грибов Mucor и Rhizopus спороношение в виде спорангиев с эндоспорангиоспорами. Спорангий находится на конце спорангиеносца. Спорангии шаровидной или грушевидной формы, у большинства с особой колонкой, являющейся продолжением спорангиеносца внутрь спорангия. Спорангиеспоры округлые, бесцветные или окрашенные.

Конидии (споры) у плесневых грибов полиморфные (цилиндрические, шаровидные, овальные, эллипсоидные, яйцевидные, грушевидные, булавовидные) одно- и многоклеточные, варьируют по размеру и окраске, одиночные, цепочками или собраны в головки и располагаются гроздьями. Поверхность конидий может быть гладкая, шероховатая, шиповатая, бородавчатая, щетинистая и т.д.

Микроскопическое исследование и посев патологического материала при микозах, вызванных диморфными грибами

При этих микозах необходимо учитывать диморфизм возбудителей.

Патологическим материалом при первично патогенных микотических инфекциях (кокцидиоидоз, гистоплазмоз, паракокцидиоидоз, североамериканский бластомикоз), а также хромомикозе, споротрихозе, и мицетомах могут быть гной, мокрота, соскобы с язвенных поражений на коже и слизистой, цереброспинальная жидкость, кровь, биопсированные кусочки из очагов поражения.

Сложность при определении возбудителей этих микозов заключается в том, что из-за их диморфизма при микроскопии патматериала будут обнаруживаться тканевые формы гриба, чаще всего дрожжевые клетки различной морфологии или сферулы с эндоспорами, совершенно непохожие на элементы этого же гриба, извлеченные из его культуры, выросшей при температуре +28 - +30 о С на обычном агаве Сабуро, со значением рН ближе к кислому. Однако нужно иметь в виду, что у некоторых диморфных грибов, можно получить и в культуре дрожжевую фазу роста гриба, часто напоминающую его тканевую форму, но при выращивании на средах, богатых белками со слабо щелочной реакцией (рН = 7,6 - 7,8), при температуре 37 о С.

Вышеуказанное относится к грибам: Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioides brasiliensis, Coccidioides immitis и Sporothrix schenckii.

Лабораторная диагностика микозов, вызванных упомянутыми здесь грибами, основана на обнаружении тканевых форм в патологическом материале при микроскопии, выделении культуры возбудителя и его идентификации по культурально-морфологическим признакам.

Микроскопическое исследование производят в неокрашенных препаратах на предметном стекле в капельке 10% растворе едкой щелочи или смеси спирта с глицерином в равных объемах или в окрашенных мазках (Табл.3).

Посев патологического материала производят на вышеуказанные питательные среды в чашках Петри с помощью бактериологического шпателя по общепринятой методике.

2.5. Микроскопическое исследование и посев патологического материала при дерматомикозах (кератомикозах и дерматофитиях).

Объектом исследования являются поверхностные микозы, поражающие только кератиновый слой эпидермиса, и дерматофиты, поражающие кожу и ее придатки (волосы, ногти), возбудителями которых являются грибы, относящиеся к родам Trichophyton, Microsporum и Epidermophyton.

Лабораторное микологическое исследование включает те же этапы, что и при других микозах: микроскопию материала и получение чистой культуры при его посеве. Правильное взятие материала чрезвычайно влияет на успех микроскопии и получение культуры.

Патологический материал исследуют в ближайшие сроки после взятия. Предварительно его делят на три части: для микроскопии, культивирования и повторного изучения. Микроскопия патологического материала - наиболее простой и быстрый метод для установления наличия гриба в тканях. Размельченный материал помещают на середину предметного стекла в каплю 10-20% раствора КОН и слегка подогревают над пламенем спиртовки до получения белесого ободка по краю капли, накрывают покровным стеклом и оставляют на 5-10 мин (волосы, кожные чешуйки) и 30 - 40 мин (ногтевые) для мацерации и просветления; материал можно обработать и без нагревания, для этого препарат оставляют в 20% растворе КОН на 30-60 мин.

Микроскопируют вначале под малым, затем большим увеличением микроскопа.

Культуральное исследование необходимо для выделения и идентификации возбудителя. Засеваемый материал максимально измельчается и засевается в минимальных количествах на скошенный агар в пробирках в 2-3 точки на расстоянии 1-2 см. Материалом одной пробы засевают не менее 2-3 пробирок (волосы) и 4-5 пробирок (кожные и ногтевые чешуйки). Для первичной изоляции дерматофитов лучше всего использовать стандартную агаризированную среду Сабуро с 2-4% глюкозы или сусло-агар, содержащие антибактериальные антибиотики (пенициллин 50 мкг/мл + стрептомицин 50 мкг/мл или биомицин 200 ед./мл) и антиплесневый антибиотик актидион (циклогексимид) 0,1 - 0,5 мг/мл. Актидион не влияет на рост дерматофитов и подавляет многие плесневые грибы, а также виды Candida и Cryptococcus.

Посевы инкубируют при 22-30 о С (лучше всего 28 о С). Появление роста дерматофитов отмечается с 4 по 12 день инкубации в точках посева по краям внесенного материала. При отсутствии роста в течение 30 дней результаты культивирования считаются отрицательными. В оптимальных условиях первичные культуры многих дерматофитов можно идентифицировать на 7-10 день после посева, но следить за посевами нужно в течение 20-30 дней. Первичные культуры растут сравнительно медленно и при использовании сред без антибиотиков дерматофиты могут быть подавлены более быстро растущими бактериями или плесневыми грибами. При появлении роста в первичном посеве необходимо произвести отсев с края колонии на свежую дифференциальную среду для получения чистой культуры, которая будет служить материалом для идентификации выделенного дерматофита.

2.6. Серологические методы диагностики микозов

Значение серологических методов состоит, главным образом, в следующем: выявление больных с вероятными инвазивными микозами; подтверждение микотической природы аллергических заболеваний; скрининговое обследование групп риска развития микозов.

Ложно положительные результаты серологических проб возможны при миконосительстве и у здоровых людей, сенсибилизированных антигенами грибов, отрицательные пробы могут быть при иммунодефиците даже на фоне протекающего инвазивного микоза.

Рутинные общепринятые методы серологической диагностики микозов
достаточно подробно описаны /П.Н.Кашкин, В.В.Лисин. "Практическое
руководство по медицинской микологии", Медицина, 1983/. Однако в последние
десятилетия произошли заметные сдвиги в методических подходах /Елинов Н.П.,
2001/. Предложены оригинальные процедуры обнаружения антигенов и антител
некоторых метаболитов клеток грибов; созданы специальные диагностические
наборы (“киты”), например Pastorex ® Candida, для определения в
реакции "латекс-агглютинации" повторяющихся олигоманнозных эпитопов антигенных
структур/, экспрессирующихся на большом числе макромолекул
гриба; для определения антигена-маннана Candida, например, в
сыворотке крови пациента с кандидемией, можно воспользоваться набором Platelia ® Candida.
С помощью первого набора порог определения антигенных структур равен 2,5 нг/мл, с помощью второго в связке с _____________методом порог определения - 0,5 нг/мл.

Возбудители микозов, наиболее часто выявляемые при лабораторном исследовании различных клинических материалов

Кровь

Candida
Cryptococcus
Мицелиальные возбудители редко выявляются при исследовании крови за исключением Fusarium

Спинномозговая жидкость

Candida
Cryptococcus

Гной, отделяемое из абсцессов, язв и пр.

Candida
Cryptococcus
Fusarium
Aspergillus
Sporotrix

Респираторные секреты (мокрота, БАЛ, бронхиальная браш-биопсия, транстрахеальный аспират)

Aspergillus
Candida
Cryptococcus
Mucor
Scedosporium
Rhizopus
Sporotrix

Отделяемое, биопсийный материал из ран

Aspergillus
Candida
Fusarium
Rhizopus

Прочие биосубстраты

Candida
Cryptococcus

Материал из грудной,брюшной полости; синовиальная жидкость

Aspergillus
Candida
Fusarium

Стекловидное тело

Candida
Aspergillus

IV. Критерии диагностики системных микозов: клинические и лабораторные параметры окончательного диагноза

Эзофагит

наличие характерных изменений при эзофагоскопии
выявление гриба при культивировании биопсийного материала
наличие псевдомицелия в окрашенных мазках или признаков инвазивного роста грибов в биопсийном материале

Пневмония

Пневмония, обусловленная Candida spp.

остро возникшие инфильтративные изменения на рентгенограмме легких, совпадающих с клиническими проявлениями грибковой пневмонии
выявление Candida spp. При культивировании материала из нижних отделов респираторного трата, полученного при трансторакальной биопсии, трансбронхиальной биопсии, открытий биопсии легкого или торокоскопически направленной биопсии
выявление псевдомицелия в адекватно окрашенном биопсийном материале

Пневмония, обусловленная Aspergillus spp., Fusarium spp., Scedosporium apiospermum

выявление элементов грибов в тканях и положительная культура
персестирующие или прогрессирующие инфильтраты в легких, резистентные к антибактериальной терапии
выявление одного из указанных возбудителей при культивировании мокроты или БАЛ
клинические признаки пневмонии (кашель, одышка, “плевральные” боли, хрипы, шум трения плевры)
характерные изменения при рентгенографии или КТ легких:

Субплевральные инфильтративные, узелковые, остроугольные или кавернозные изменения

Симптом “ореола” при КТ легких

Прогрессирование инфильтративных изменений с образованием полостей и появлением симптома “серпа”

отсутствие других возбудителей при культивировании БАЛ, которые могли бы вызвать представленные изменения легких

Синусит

клинические и рентгенологические признаки острого синусита
микроскопические и культуралъные признаки микоза при исследовании аспирата или биопсийного материала

Инфекция мочевыводящих путей

выявление >1х10 кое/мл при повторных посевах правильно собранной мочи

Фунгемия

Однократное выявление грибов при посеве крови в период подъема температуры тела > 38 о С

Острый диссеминированный микоз

Фунгемия в сочетании с культуральными или гистологическими признаками поражения глубоких тканей (включая подкожную клетчатку) или выявление возбудителя из двух в норме стерильных биосубстратов

Эндофтальмит

офтальмологические признаки эндофтальмита
выявление возбудителя из глаза, крови или других очагов диссеминации

Абсцесс или остеомиелит

рентгенографические/КТ/МРТ признаки остеомиелита
выявление возбудителя в аспирате или биопсийном материале

Менингит

определение изменений СМЖ, подтверждающих наличие воспаления, и выявление грибов при микроскопии СМЖ
выявление грибов при посеве СМЖ или определение антигенов Cr.neoformans, Candida и Aspergillus в СМЖ

Хронический диссеминированный (гепатолиенальный) кандидоз

Возможный

персистирующая или интермиттирующая лихорадка после завершения периода нейтропении в сочетании с характерными признаками поражения печени, селезенки или почек

Доказанный

вышеуказанное в сочетании с высевом Candida spp. из крови до появления признаков поражения печени, селезенки или почек или с культуральными, гистологическими признаками кандидоза в биопсийном материале из очагов

V. ВОЗБУДИТЕЛИ ГРИБКОВЫХ ИНФЕКЦИЙ

Существуют различные принципы классифицирования грибковых инфекций и их возбудителей. Нам представляется практически наиболее простым и целесообразным разделить патогенные грибы на 5 основных групп:

1. Возбудители поверхностных микозов;

2. Возбудители дерматомикозов;

3. Возбудители подкожных микозов;

4. Возбудители глубоких микозов (первично-патогенные микромицеты, возбудители оппортунистических инфекций).

5. Возбудители псевдомикозов.

* Следует подчеркнуть, что возбудители первых трех групп у иммуносупрессированных пациентов могут быть причиной фунгемии и полиорганных поражений.

Описание возбудителей микозов в последующих разделах мы даем по единой схеме: его наименование по принятой номенклатуре, перечень синонимов, макроскопическую характеристику колоний на питательных средах и микроскопическую характеристику элементов гриба, видимых под микроскопом в нативных препаратах и из колоний. Приводятся также данные о распространении грибов в природе и перечисляются вызываемые ими заболевания.

Прецизионная диагностика инвазивных микозов нелегка. Это объясняется не только трудностями в получении культуры грибов, но и в интерпретации результатов исследований, поскольку грибами, как дрожжевыми, так и мицелиальными, возможны колонизация слизистых оболочек, контаминация исследуемых образцов. В связи с этим диагностика инвазивных микозов базируется на комплексном подходе, включающем не только результаты микологических (культуральных) и серологических (определение антигена грибов) исследований, но и клинические симптомы грибковой инфекции, данные вспомогательных методов исследований (компьютерная или магнитно-резонансная томография, ультразвуковое исследование).

Европейско-американской кооперированной группой по изучению инвазивных микозов у иммунокомпрометированных больных разработаны критерии диагностики инвазивных микозов. Они представлены в 2001 г. на Международной конференции по антимикробным препаратам и химиотерапии (ICAAC, Chicago), а в 2002 г. в печати. Определены критерии доказанного, вероятного и возможного инвазивного микоза, которые рекомендуется использовать при клинических и эпидемиологических исследованиях

Доказанный инвазивный микоз, вызванный мицелиальными грибами : обнаружение мицелия грибов в биоптатах либо аспиратах при гистологическом или цитологическом исследовании или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи и со слизистых оболочек.

Доказанный инвазивный микоз, вызванный дрожжевыми грибами : обнаружение дрожжевых клеток (грибы рода Candida могут формировать псевдомицелий или истинный мицелий) в биоптатах или аспиратах, за исключением образцов со слизистых оболочек, или выделение культуры из образцов, полученных в асептических условиях из стерильного в норме очага, который по результатам клинического и радиологического исследований связан с инфекцией, за исключением исследований мочи, образцов из пазух носа и со слизистых оболочек, или обнаружение при микроскопии и специфическом окрашивании (в капле туши, окраска муцикармином) дрожжевых клеток либо положительного антигена Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости.

Фунгемия, обусловленная мицелиальными грибами : выделение гемокультуры грибов, за исключением Aspergillus spp. и Penicillium spp., включая Penicillium marneffei, в сочетании с клиническими симптомами инфекционного процесса, совместимыми с выделенным возбудителем.

Фунгемия, обусловленная дрожжевыми грибами : выделение гемокультуры грибов рода Candida или иных дрожжевых грибов у пациентов с клиническими признаками инфекции, связанными с данным возбудителем.

Комплекс диагностических исследований при инвазивных микозах

Исследуемый биоматериал	Показания, используемые среды, значение
Кровь	Показания : стойкая лихорадка (4-5 дней и более) на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия; вторая «волна» лихорадки на фоне терапии антибиотиками Забор крови из вены во флаконы для аэробных бактерий* или в селективную среду для грибов, неоднократный (2-3 раза в течение суток с интервалом 1 ч) Диагностическая значимость : выделение дрожжевых грибов, осторожная интерпретация при выделении мицелиальных грибов, за исключением Fusarium spp.
Венозный катетер	Показания : выделение дрожжевых грибов из крови Центральный или периферический венозный катетер удаляют во всех случаях выделения дрожжевых грибов из крови Для микологического исследования используют асептически удаленный дис-тальный отрезок катетера длиной 5- 6 см. Исследование проводят полуколичественным (Maki method) или количественным методом на среде Сабуро Диагностическая значимость : выделение дрожжевых грибов при полуколичественном исследовании 15 КОЕ или более, при количественном - 103КОЕ/мл или более для подтверждения диагноза катетерассоциированной инфекции или инфицирования катетера
Отделяемое верхних дыхательных путей, мокрота, смывы из трахеи, бронхов, жидкость бронхоальвеолярного лаважа	Показания : подозрение на микозы, вызванные мицелиальными грибами или Cryptococcus neoformans; длительная лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия и нейтропении Микроскопия образцов с калькофлуором белым (обнаружение мицелия или псевдомицелия); посев на среду Сабуро; определение антигена Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа при наличии очагов в легких, характерных для инвазивного аспергиллеза Диагностическая значимость : выделение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans
Цереброспинальная жидкость	Показания : симптомы менингита; обнаружение очага (очагов) в головном мозге при компьютерной или магнитно-резонансной томографии; «мозговая» симптоматика на фоне лихорадки и нейтропении Микроскопия с калькофлуором белым, в капле туши; определение антигена Aspergillus, Cryptococcus; посев на среду Сабуро Диагностическая значимость : обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных; положительный антиген
Биоптаты, аспираты, перитонеальная жидкость, плевральная жидкость	Показания : клинические и/или радиологические признаки инвазивного микоза; лихорадка на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия. Микроскопия с калькофлуором белым, посев на среду Сабуро Диагностическая значимость : обнаружение грибов как дрожжевых, так и мицелиальных

* Частота выделения грибов из крови была идентичной при исходном взятии крови как во флаконы со средой для культивирования бактерий, так и с селективной средой для грибов. Изучение проведено на бактериологическом анализаторе ВАСТЕС 9240.

Вероятный инвазивный микоз диагностируют при совокупности следующих критериев:
один признак из категории микробиологических критериев;
один признак из категории «значимых» или два из группы «менее значимых» клинических симптомов инфекционного процесса.

Возможный инвазивный микоз диагностируют на основании совокупности следующих критериев:
наличие хотя бы одного фактора риска, индуцирующего развитие инвазивного микоза;
один признак из категории микробиологических критериев или один признак из категории «значимых» (два из группы «менее значимых») клинических симптомов инфекционного процесса.

Понятие «возможный инвазивный микоз » не рекомендуется использовать в клинических исследованиях по изучению эффективности протигрибковых препаратов. Можно пользоваться этим термином при анализе эмпирической противогрибковой терапии, эпидемиологических исследований, изучении фармакоэкономики.

При микологическом исследовании стерильных аспиратов или биоптатов принимают во внимание выделение не только культуры грибов, но и обнаружение при микроскопии мицелия или псевдомицелия. В гистологических препаратах аспергиллы трудно дифференцировать от Fusarium spp., Sceclosporium apiospermum и некоторых других мицелиальных грибов. Для дифференциальной диагностики следует проводить иммуногистохимическое исследование с антителами к аспергиллам.

Выделение дрожжевых грибов из крови хотя бы в одном исследовании относится к категории «доказанного» инвазивного микоза и является абсолютным показанием к назначению системных антимикотиков больным с нейтропенией. Частота выявления дрожжевых грибов из крови невысокая, даже при диссеминированном кандидозе она составляет 35-50 %.
Проведение повторных посевов крови повышает вероятность получения положительных результатов.

Иная интерпретация результатов в случае обнаружения мицелиальных грибов в крови. Высокая частота выделения мицелиальных грибов характерна для Fusarium spp. и составляет 40-60 %. Aspergillus обнаруживают крайне редко, в большинстве случаев это рассматривается как контаминация, за исключением Aspergillus terreus.

Выделение Aspergillus terreus из крови больных с гемобластозами может свидетельствовать об истинной аспергиллемии, а при наличии клинических симптомов инфекции является основанием для назначения антимикотиков.

Критерии инвазивного микоза

Показатель	Критерии
Факторы, индуцирующие возникновение инвазивного микоза (макроорганизм)	Нейтропения (< 0,5*109/л в течение 10 дней) Персистирующая лихорадка в течение более 96 ч на фоне терапии антибиотиками широкого спектра действия Температура тела выше 38 °С или ниже 36 °С и любой из следующих предрасполагающих признаков: длительная нейтропения (более 10 дней) в течение предыдущих 60 дней, интенсивная им-муносупрессивная терапия в течение последних 30 дней, доказанный или вероятный инвазивный микоз в предыдущий период нейтропении либо СПИД Наличие симптомов РТПХ, прежде всего случаи тяжелого течения (II степени) или экстенсивное течение хронической болезни Длительное (более 3 нед) применение глюкокортикоидов в течение последних 60 дней
Микробиологические признаки	Выделение культуры мицелиальных грибов (включая Aspergillus spp., Fusaruim spp., Sceclosporium spp. и зигомицеты) и Cryptococcus neqformans из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа Положительные результаты культурального или цитологического исследования (прямой микроскопии) по обнаружению мицелиальных грибов из аспиратов придаточных пазух носа Обнаружение мицелиальных грибов или Cryptococcus neoformans при цитологическом исследовании/ прямой микроскопии из мокроты или жидкости бронхоальвеолярного лаважа Положительный антиген Aspergillus в жидкости бронхоальвеолярного лаважа, цереброспинальной жидкости и образцах крови (не менее двух) Положительный антиген криптококка в образцах крови Обнаружение при цитологическом исследовании или прямой микроскопии элементов грибов в образцах стерильных в норме жидкостей (например, Cryptococcus spp. в цереброспинальной жидкости) Два положительных результата исследований по обнаружению культуры дрожжевых грибов в моче при отсутствии мочевого катетера Кристаллы Candida в моче при отсутствии мочевого катетера Выделение Candida spp. из гемокультур
Клинические признаки Нижние дыхательные пути	Должны быть сопряжены с локусом, откуда берут образцы для микробиологического исследования Любой из следующих типов новых инфильтратов в легких по данным КТ: симптом «ореола», симптом «полумесяца», полость с участками консолидации* Симптомы инфекции нижних дыхательных путей (кашель, боль в грудной клетке, кровохарканье, диспноэ), шум трения плевры, любой новый инфильтрат, не включенный в признаки высокой степени значимости; плевральный выпот
Верхние дыхательные пути Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости	Радиологические признаки инвазивной инфекции в пазухах носа (эрозия стенки или распространение инфекции на прилежащие структуры, экстенсивная деструкция костей черепа) Насморк, заложенность носа, изъязвления слизистой оболочки носа, носовое кровотечение, периорбитальный отек, боль в области верхней челюсти, некротические изъязвления черного цвета или перфорация твердого неба
Центральная нервная система Признаки высокой степени значимости Признаки меньшей степени значимости	Рентгенологические признаки предполагаемой инфекции ЦНС (мастоидит или другой параменингеальный фокус, экстрадуральная эмпиема, множество очагов в веществе головного или спинного мозга) Фокальные неврологические симптомы и признаки, включая фокальные судороги, гемипарез; расстройства сознания, менингеальные симптомы, нарушения биохимического состава цереброспинальной жидкости и ее клеточного состава (при отсутствии других возбудителей, по данным культурального исследования и микроскопии, при отсутствии опухолевых клеток)

*При отсутствии инфекции, обусловленной микроорганизмами, способными вызвать аналогичную радиологическую картину, включая образование полостей (Mycobacterium spp., Legionella spp., Nocardia spp.).

При выявлении в крови или иных стерильных биосубстратов дрожжевых грибов обязательно следует проводить идентификацию до вида и определять чувствительность к противогрибковым препаратам, при выделении мицелиальных (плесневых) грибов - только идентификацию до вида, чувствительность не определяют.

В клинической практике чувствительность мицелиальных грибов не исследуют по причине несовершенства стандартов по определению чувствительности таких грибов к антимикотикам. Более того, только в одном исследовании продемонстрирована корреляция между чувствительностью Aspergillus spp. и результатами лечения инвазивного аспергиллеза у больных с гемобластозами. Ни в одном из исследований, проведенных в последующем, не получено подобных результатов.

В последнее время стали появляться единичные сообщения о формировании приобретенной резистентности грибов A. fumigatus к итраконазолу, вориконазолу.

Идентификация грибов до вида , особенно полученных из стерильных локусов, необходима прежде всего для выбора антимикотика и проведения адекватной противогрибковой терапии. Так, Candida krusei устойчивы к флуконазолу и менее чувствительны, чем дрожжевые грибы другого вида, к амфотерицину В; Aspergillus terreus, Scedosporium apiospermum (Pseudallescheria boydii), Trichosporon beigelii, Scopulariopsis spp. резистентны к амфотерицину В; Mucorales резистентны к итраконазолу, вориконазолу, Candida glabrata проявляет дозозависимую чувствительность к флуконазолу, и при выделении этого вида гриба, даже чувствительных штаммов, дозу флуконазола следует увеличить (взрослым назначают 800 мг вместо 400 мг); Candida lusitaniae устойчивы к амфотерицину В.

Идентификация грибов до вида также важна для проведения эпидемиологического анализа в стационаре - определения возбудителей вспышек инфекции и по возможности источника инфекции. Описаны вспышки инфекции, вызванные такими редкими грибами, как С. lusitaniae, С. krusei, С. lipolytica.

На основании видовой идентификации грибов можно предположить инвазивный микоз или колонизацию грибами слизистых оболочек. Например, Aspergillus niger существенно реже, чем Aspergillus fumigatus, являются причиной инвазивного аспергиллеза у больных острыми лейкозами. Выделение из жидкости бронхоальвеолярного лаважа Aspergillus niger чаще всего расценивается как колонизация дыхательных путей, а из мокроты - как контаминация из воздуха и требует дополнительных исследований при подтверждении диагноза инвазивного аспергиллеза.

На основании выделения мицелиальных грибов из мокроты, бронхоальвеолярной жидкости, аспирата околоносовых пазух можно только предполагать инвазивный микоз, не включая его в категорию «доказанного». Тем не менее обнаружение Aspergillus в мокроте, особенно Aspergillus fumigatus или Aspergillus flavus, у пациентов с нейтропенией, реципиентов аллогенного костного мозга всегда должно быть принято во внимание. Это требует повторного проведения микологического исследования и компьютерной томографии легких. Так, при нейтропении вероятность выявления инвазивного аспергиллеза в случае положительной культуры Aspergillus spp. в мокроте составляет 80 %.

Выделение Cryptococcus neoformans у иммунокомпрометированных больных из респираторного тракта (смывы, лаваж) является диагностически значимым. Если идентификация дрожжевых грибов из жидкостей, полученных из дыхательных путей (смывы из трахеи, бронхов, бронхоальвеолярный лаваж) иммунокомпрометированных больных, не относится к обязательным исследованиям, то проведение скрининга по выявлению Cryptococcus neoformans из этих образцов является необходимым.

Обнаружение кандид в моче у больных с нейтропенией и лихорадкой, как правило, считается проявлением диссеминированной кандидозной инфекции.

В своевременной диагностике инвазивного успешно пользуются коммерческим тестом по выявлению циркуляции специфического антигена грибов Aspergillus spp. галактоманна (полисахаридный водорастворимый компонент клеточной стенки гриба).

Галактоманн может быть определен двумя методами: методом латекс-агглютинации (Pastorex Aspergillus, фирмы BioRAD) и методом иммуноферментного анализа (Platelia Aspergillus, фирмы BioRAD).

Преимуществом иммуноферментного метода является более низкий порог чувствительности определения уровня галактоманна в крови - 1 нг/мл и менее, а с помощью латекс-агглютинации - 15 нг/мл. Диагностическое значение имеет определение галактоманна в крови (не менее чем в 2 образцах), цереброспинальной жидкости, бронхоальвеолярном лаваже. Чувствительность метода иммуноферментного анализа составляет около 90 %, специфичность 90-99 %, у реципиентов аллогенного костного мозга данные показатели ниже и равны соответственно 60-70 % и 80-90 % вследствие профилактического применения противогрибковых препаратов (антимикотики снижают пороговый уровень галактоманна).

В 40 % случаев выявление галактоманна в крови опережает проявления инвазивного аспергиллеза, определяемые при компьютерном исследовании легких, а в 70 % опережает клинические симптомы инфекции.

Диагностическую значимость тест по выявлению антигена Aspergillus имеет в том случае, если исследование проводят неоднократно. Определение антигена Aspergillus в крови следует проводить при лихорадке на фоне лечения антибиотиками широкого спектра действия у больных с нейтропенией 2 раза в неделю; при пневмониях, которые возникают или сохраняются на фоне антибактериальной терапии; при обнаружении очагов в легочной ткани (компьютерная томография).