Окраска гематоксилином и эозином. Методика окрашивания срезов гематоксилин - эозином

1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.

10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов

1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.

2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.

3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.

5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.

6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.

7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.

Окрашивание срезов для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).

Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор

гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl 3 , 6Н 2 0). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематоксилин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллированной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессивный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интенсивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в ксилоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окрашивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифференцируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллированной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез фильтровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашивании гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.

Вопросы для самопроверки

Определение гистологии как науки.
Объекты исследования гистологии.
Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
Какие группы красителей используют в гистологической практике?
Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
Объясните принцип работы на микротоме?
Техника приготовления тотальных препаратов.
Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
Типы микроскопов.
Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
Правила оформления лабораторной работы.
Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
Различные методы окраски гистологических срезов.
Методы окрашивания для обзорных целей.

Орсеин
Эта гистологическая окраска используется для выявления эластиновых волокон, особенно это актуально в патологической анатомии кровеносных сосудов. Этот краситель добывается из нескольких видов лишайников. На снимке ниже представлены эластиновые мембраны аорты - самого крупного сосуда тела человека, функция которого заключается смягчить, мощную «ударную волну» сердечного сокращения и провести поток крови к более мелким ветвям. Аорта относится к сосудам эластического типа, так как в ее стенке содержится множество таких эластиновых мембран, куда больше чем в артериях других типов.

Автор фотографии: уточняется
Источник: University of Tasmania. School of Medicine secure.health.utas.edu.au

Осмия тетрооксид (Оксид осмия(VIII))
Другая окраска на жироподобные вещества, хотя сейчас, чаще используется как фиксатор для приготовления препаратов для электронной микроскопии. Он связывает ненасыщенные липиды (в области двойных связей) и, таким образом ткани с большим количеством полиненасыщенных жиров окрасятся в черный цвет. На снимке ниже - отличный пример поперечный срез нервного волокна. Черные кружки - отдельные аксоны с их оболочкой, которая богата миелином - веществом, являющегося своего рода изолятором для нервного волокна, и способствующего распространению нервного импульса, а также очень охотно связывающим высший оксид осмия.

Автор фотографии: уточняется
Источник:vetmed.vt.edu

Изображение изстатьиHistopathologic Changes in Growth-Plate Cartilage Following Ischemic Necrosis of the Capital Femoral Epiphysis An Experimental Investigation in Immature Pigs . Harry K.W. Kim , MD, FRCS(C); Phi-Huynh Su , BSc; Yu-Shan Qiu , MD , опубликованной в J Bone Joint Surg Am , 2001 May;83(5):688-697
Источник:jbjs.org

Окраска по Фон Косса (von Kossa)
Эта окраска используется для исследования степени минерализации ткани, то есть выявления выпавших в ткани нерастворимых фосфатов. Принцип окраски заключается в преципитации ионов серебра в кислой среде. Фотохимический распад образующихся фосфатов серебра до металлического серебра, происходящий под воздействием света (процесс, по своей сути, аналогичен таковому происходящему при печати фотографий) позволяет выявить наличие в ткани фосфатов, (чаще всего именно фосфатов кальция), но окраска выявляет лишь присутствие фосфатов, а не кальция самого по себе. Для выявления солей кальция требуются другие окраски, например, уже описанный, ализарин красный. Цветовая схема при этой окраске следующая: фосфаты кальция в массивных депозитах - черного цвета, в мелкодисперсных отложениях - серого. Клеточные ядра - красные, а цитоплазма клеток - светло-розового цвета.

Автор фотографии: уточняется
Источник:iupui.edu

Окраска берлинской лазурью
Она же железная лазурь, прусский синий, парижская лазурь, прусская лазурь, гамбургская синь, нейблау, в гистологии же известна как реакция Перлса. Этот метод очень распространен в гистологии для выявления в тканях соединений железа (например, при диагностике гемохроматозов и выявления гемосидероза - состояний при которых в тканях, по тем или иным причинам, накапливается избыток соединений железа, что, в конечном счете, приводит к недостаточности внутренних органов). Но, что интересно, здесь используется не готовый пигмент для окраски, а образование пигмента в этом случае, происходит непосредственно в срезе ткани и его образование, связанное с присутствием соединений железа, расценивается как положительная реакция.
Оригинальная методика окраски, описанная в 1867 году как «берлинская лазурь Перлса» названа в честь ее автора - германского патолога Макса Перлса (Max Perls) (1843-1881), использовавшего растворы гексацианоферрата (II) калия и соляной кислоты. Депозиты соединений железа в тканях под действием этих растворов образуют собственно берлинскую лазурь, гранулы которой, цвета разных оттенков синего, видны в препарате под микроскопом.
Макрофаги нагруженные железосодержащим пигментом гемосидерином в печени мыши. Селезенка является своего рода "кладбищем для эритроцитов" здесь эритроциты отслужившие свой век (это около 120 дней) задерживаются и разрушаются, а из пигмента гемоглобина извлекается "железо" и используется для синтеза новых молекул кислородсвязывающего белка - гемоглобина.

Автор фотографии: уточняется
Источник: iupui.edu

Срез ткани легкого со скоплениями макрофагов нагруженных гемосидерином. Такие скопления появляются при хронической "застойной" левожелудочковой сердечной недостаточности, когда в системе легочной артерии поднимается давление, из-за того что сердце не может "перекачать" кровь из малого в большой круг кровобращения. Когда давление в ветвях легочной артерии повышено, в полоси альвеол так или иначе начинают проникать эритроциты, они фагоцитируются альвеолярными макрофагами в цитоплазме которых, со временем, накапливается бурый железосодержащий пигмент - гемосидерин, когда таких клеток становится достаточно много (при прогрессирующей сердечной недосточности) они начинают выделятся с мокротой, которая приобретает ржавый оттенок, в такой мокроте при микроскопии можно выявить эти альвеолярные макрофаги, наполненные гемосидерином, их иногда называют клетками сердечных пороков, так как такая степень сердечной недостаточности особенно часто наблюдается при пороках сердца, хотя они также встречаются и при легочных кровотечениях и инфарктах легкого.

Автор фотографии: Yale Rosen
Источник: flickr.com/photos/pulmonary_pathology

Пикросириус красный
Применяется для селективного выявления коллагена I и III типа. Окрашенные по этому методу препараты могут быть исследованы как при помощи стандартной светлопольной световой микроскопии, тогда коллагеновые волокна будут окрашены в ярко-красный цвет, на бледно-желтом фоне, а клеточные ядра, в идеале, - черного цвета, но также могут быть серые или коричневые.

Изображение из статьи “Salt Induces Myocardial and Renal Fibrosis in Normotensive and Hypertensive Rats ”. Henry C. M . Yu , MBChB, MRCP, FRACP, FHKCP; Louise M. Burrell , MBChB, MD, FRACP; M. Jane Black , BSc, PhD; Leonard L. Wu , PhD; Rodney J. Dilley , BSc, PhD; Mark E. Cooper , MBBS, PhD, FRACP; Colin I. Johnston , MBBS, FRACP

Гистологический образец лёгочной ткани человека, окрашенный гематоксилин-эозином.

Окраска гематоксилином и эозином (окраска гематоксилин-эозином) - один из самых распространённых методов окраски в гистологии . Широко используется в медицинской диагностике, в частности в онкологии для окраски ткани, полученной при биопсии .

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро , рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточные белки , например, тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой. Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

Техника окраски гематоксилин-эозином

Удаляют парафин из срезов в орто-ксилоле или толуоле , проводят по спиртам нисходящей концентрации и доводят до воды (две порции ксилола или толуола – 3-5 минут, 96° этанол – 3 минуты, 80° этанол – 3 минуты, 70° этанол – 3 минуты, дистиллированная вода – 5 минут).
Окрашивают гематоксилином 7-10 минут (в зависимости от зрелости красителя).
Промывают в дистиллированной воде – 5 минут.
Дифференцируют в 1% соляной кислоты на 70° этаноле до побурения срезов.
Промывают дистиллированной водой, а затем слабым (0,5 %) раствором аммиака до посинения срезов.
Окрашивают водным раствором эозина 0,5-1 минуту (в зависимости от желаемой окраски).
Промывают в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина.
Удаляют воду из срезов в одной порции 70° этанола, двух порциях 96° этанола. Экспозиция в каждой порции спирта – 2 минуты.
Просветляют срезы в двух порциях карбол-ксилола (смесь расплавленного фенола и ксилола либо толуола в соотношении 1:4 или 1:5) – 1 минута.
Производят окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или толуола. Прибывание срезов 2 минуты.
Заключить срезы в канадский бальзам или синтетическую среду для заключения гистологических срезов.

Некоторые структуры плохо прокрашиваются гематоксилином и эозином (как правило гидрофобные) и требуют иных методов окраски. Например, участки клеток, богатые липидами и миелином, остаются неокрашенными: адипоциты , миелиновая оболочка аксонов нейронов , мембрана аппарата Гольджи и др.

См. также

Ссылки

Rosen Lab, Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) Step by step protocol

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Окраска гематоксилином и эозином" в других словарях:

Гистологический образец лёгочной ткани человека, окрашенный гематоксилин эозином. Окраска гематоксилин эозин (окраска гематоксилином и эозином) является одним из самых распространённых методов гистологии. Широко используется в медицинской… … Википедия

Туберкулез органов дыхания. Органы дыхания при туберкулезе (Туберкулёз органов дыхания) поражаются наиболее часто. В соответствии с принятой в нашей стране клинической классификацией туберкулеза различают следующие формы Т. о. д.: первичный… … Медицинская энциклопедия

I Сердце Сердце (лат. соr, греч. cardia) полый фиброзно мышечный орган, который, функционируя как насос, обеспечивает движение крови а системе кровообращения. Анатомия Сердце находится в переднем средостении (Средостение) в Перикарде между… … Медицинская энциклопедия

- (leucoscs; греч. leukos белый + ōsis; синоним лейкемия) заболевания опухолевой природы, протекающие с вытеснением нормальных ростков кроветворения: опухоль возникает из кроветворных клеток костного мозга. Заболеваемость Л. неодинакова в различных … Медицинская энциклопедия

I Пневмония (pneumonia; греч. pneumon легкое) инфекционное воспаление легочной ткани, поражающее все структуры легких с обязательным вовлечением альвеол. Неинфекционные воспалительные процессы в легочной ткани, возникающие под влиянием вредных… … Медицинская энциклопедия

Туберкулез внелегочный условное понятие, объединяющее формы туберкулеза любой локализации, кроме легких и других органов дыхания. В соответствии с клинической классификацией туберкулеза (Туберкулёз), принятой в нашей стране, к Т. в. относят… … Медицинская энциклопедия

I Плацента (лат. placenta лепешка; синоним детское место) развивающийся в полости матки во время беременности орган, осуществляющий связь между организмом матери и плодом. В плаценте происходят сложные биологические процессы, обеспечивающие… … Медицинская энциклопедия

I Забрюшинное пространство (spatium retroperitoneale; синоним ретроперитонеальное пространство) клетчаточное пространство, расположенное между задней частью париетальной брюшины и внутрибрюшной фасцией; простирается от диафрагмы до малого таза. В … Медицинская энциклопедия

I Матка Матка (uterus, metra) непарный мышечный полый орган, в котором происходят имплантация и развитие зародыша; расположен в полости малого таза женщины. Органогенез Развитие М. во внутриутробном периоде начинается при длине плода около 65 мм … Медицинская энциклопедия

I Мокрота (sputum) выделяемый при отхаркивании патологически измененный трахеобронхиальный секрет с примесью слюны и секрета слизистой оболочки носа и придаточных (околоносовых) пазух. В норме трахеобронхиальный секрет состоит из слизи,… … Медицинская энциклопедия

Широкое применение гематоксилина в микроскопической технике обусловлено его замечательными свойствами как красителя растительного происхождения. Уникальность происхождения и отличительные природные свойства позволяют говорить о незаменимости свойств этого продукта в научных исследованиях и лабораторной диагностике.

Гематоксилин - краситель растительного происхождения, который содержится вформе гликозида в соке кампешевого дерева (Haematoxylon campechianum), произрастающего в Индии и Америке. Родиной же этого дерева является Южная Мексика, область Кампече.Кампешевый экстракт, содержащий гематоксилин, изначально применялся для окраски тканей в текстильной промышленности. В качестве гистологического красителя гематоксилин стал применяться с середины XIX века. Гематоксилин, введенный в микротехнику Вальдейером в 1882 году, положил начало разработке ценнейших методов окраски. Первый рецепт квасцового гематоксилина был предложен Бемером в 1865 году. И в XX веке стал главным красителем, применяемым для окраски ядер клеток.

Химические свойства гематоксилина

Гематоксилин представляет собой бесцветные или слабо окрашенные кристаллы сладкого вкуса, приобретающие под действием света, а также на воздухе красновато-желтую окраску. Гематоксилин малорастворим в холодной воде, но растворим в воде горячей (особенно в присутствии буры), этиловом спирте, глицерине, плохо растворим в диэтиловом эфире. Со щелочами дает растворы пурпурного цвета, который быстро переходит в синевато-фиолетовый, а затем в коричневый. Разбавленные кислоты на гематоксилин не действуют. Обладает свойствами кислотно-основного индикатора. Брутто-формула гематоксилинаС16Н14О6 CAS 517-28-2, а наиболее часто встречающиеся синонимы: Haematoxylin, Hematoxylin, Natural Black 1, C .I. 75290, гидроксибразилин, оксибразилин.

Применение

Сам по себе гематоксилин не представляет пигмента, но при окислении гематоксилина чрезвычайно легко образует пигмент гематеин, который в свою очередь дает различные продукты более глубокого окисления, неприменимые для окрашивания. Все рецепты приготовления гематоксилина для окрашивания препаратов имеют своей целью превращение гематоксилина в гематеин. Но ни гематоксилин, ни гематеин не способны давать окрашивание без протрав, с которыми они образуют солеобразные соединения - лаки. В качестве протрав используют соли алюминия, железа, меди, хрома, молибдена, ванадия. Самыми распространенными протравами являются соединения алюминия (в виде алюмоаммонийных или алюмокалиевых квасцов) или железа (хлорид железа или железоаммонийный квасцы). Другие протравы используются гораздо реже и включают хромовые квасцы и фосфорновольфрамовую кислоту.

Гематоксилин Гематеин

Растворы гематоксилина

Существуют многочисленные способы приготовления красящих растворов из гематоксилина, хотя суть всех этих методов заключается в одном - его окислении.

Методы с железным гематоксилином

Существуют два метода окрашивания железным гематоксилином - регрессивный и прогрессивный. Первый основан на избыточном окрашивании и последующей дифференцировке путем отмывания в соответствующей жидкости; при этом соли железа вводят в раствор красителя либо обрабатывают ими срезы перед окрашиванием. Жидкость, служащая для дифференцировки, после окончания процедуры должна быть тщательно отмыта. Если она не отмыта, то продолжает действовать после достижения желательной степени дифференцировки и может испортить окраску.

В прогрессивном методе используют кислые растворы или избыток солей железа, что позволяет избежать переокрашивания.

К методам окрашивания с железным гематоксилином обычно относят:

· Железный гематоксилин Брусси.

· Железный гематоксилин Вейгерта.

· Железный гематоксилин по Ясвоину.

· Железный гематоксилин по Рего.

· Железный триоксигематеин по Ганзену.

· Окраска хлористожелезным гематоксилином по Геквисту.

Методы с квасцовыми гематоксилинами

Комплексы гематоксилина с солями алюминия обычно готовят, используя двойной сульфат аммония и алюминия или алюмо-аммониевые квасцы. Такие комплексы обычно называются квасцовым гематоксилином. Иногда вместо аммониевых используются калиевые или натриевые квасцы, причем результаты окрашивания не изменяются. Так как красящим началом является гематеин, а соли алюминия в отличие от солей трехвалентного железа не являются окислителями, растворы квасцового гематоксилина перед использованием необходимо окислить или дать им “вызреть”. Гематеин медленно образуется при пропускании пузырьков воздуха через растворы гематоксилина (для получения однородных результатов может понадобиться 3-4 недели), при выдерживании растворов в открытых сосудах в течение нескольких недель; гематеин образуется также в твердом красителе, хранящемся в открытом сосуде во влажной атмосфере. Большинство химических окислителей, таких, как перекиси, иодаты, перманганаты, перхлораты, окись ртути и соли трехвалентного железа, окисляют гематоксилин сразу, хотя некоторые из них действуют при нагревании.

Избирательность окраски ядер квасцовым гематоксилином возрастает в присутствии избытка солей алюминия или еще в кислых растворах.

К методам окрашивания с квасцовыми гематоксилинами обычно относят:

· Кислый гемалаун Майера.

· Двойная окраска гемалаун-эозином.

· Квасцовый гематоксилин но Эрлиху.

· Окраска гематоксилином Делафильда.

· Окраска квасцовым гематоксилином по Ганзену.

· Квасцовый гематоксилин по Карацци.

Также широкое распространение получили следующие методы:

· Методика окраски срезов с дифференцировкой

· Методика окраски гематоксилин-эозином на предметном стекле.

· Методика проведения окраски парафиновых срезов гематоксилин-эозином по методу Бемера.

· Методика окраски гематоксилин-эозином

Более подробно о вышеперечисленных методах можно прочитать .

Неоднократно предпринимались попытки отыскать более дешевую и удобную замену гематоксилину для применения в микроскопической технике. Предлагали использовать такие природные красители, как сок черники, черной смородины, синтетические красители (антоциан ВВ, феноцианин ТС, галлеин, бразилин, ализариновый синий S, целестиновый синий). Однако ни один из данных заменителей в настоящее время не смог полностью заменить гематоксилин. Во многом поэтому, на сегодняшний день, гематоксилин незаменим в научных исследованиях и лабораторной диагностике.

По материалам статьи Горбуновой Т.К.

«Электронный математический и медико-биологический журнал» . - Т. 7. - Вып. 1. - 2008.

Окрашивание срезов в гистологии для обзорных целей

Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей.

Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем- цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина.

Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха.

Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином.

Железный гематоксилин Гейденгайна

окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 нед. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кристаллы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раствором гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта

готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта 1 и раствора Вейгерта 2. Раствор Вейгерта 1 представляет собой 1% раствор гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта 2 имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официальный раствор полуторахлористого железа-это 50% раствор водного хлорного железа (FеСI3* 6Н20). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором соляной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый кармин приготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания -0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, особенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители.

Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для до окрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окрашивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроцитьи красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематоксилин - эозином.

Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженньие срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-3О мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий:

1) срезы переносят в дистиллированную воду;