Бактериоскопическое исследование мазка. Окраска - микробиология с техникой микробиологических исследований

Микроорганизмы в своем нативном состоянии не видны не только в оптические, но и в электронные микроскопы. Причиной подобного явления является их прозрачность – ткани микроорганизма имеют коэффициент преломления света подобный стеклу.

Для изучения прокариотов под микроскопом используются различные методы окрашивания, что дает возможность придать цвет бактериям или их частям. Кроме того, микробы обладают – важной особенностью, состоящей в неодинаковом взаимодействии различных тканей прокариота с красителем.

Окрашивание бактерий

Способов придать цвет микроорганизмам много.

В зависимости от предмета окрашивания используемые для этого методики подразделяют на:

  • позитивные способы, окрашивающие ткани микроорганизмов;
  • негативные методы – окрашивающие пространство вокруг бактерии, в результате чего она становится видна как силуэт на окрашенном фоне.

Методика придания цвета микробам основана на присутствии в клетках кислотоустойчивых прокариотов оксикислот, липидов и воска, что является причиной неудовлетворительного окрашивания разведенными красителями.

При окрашивании по Цилю-Нельсону фиксированный препарат обрабатывают карболовым фуксином Циля и подогревают над горелкой до появления паров, охлаждают и повторяют процесс 3 раза. По завершении препарат промывают водой, обесцвечивают раствором серной или соляной кислот и тщательно промывают. Далее препарат в течение 1 минуты обрабатывают раствором метиленового синего, промывают водой и высушивают.

В результате цвет кислотоустойчивых микроорганизмов – интенсивно красный, на фоне остальной микрофлоры, имеющей светло-синюю окраску.

При необходимости дифференцировать бактерии лепры от применяется метод Семеновича-Марциновского:

  • бактерии лепры окрашиваются в голубой цвет;
  • возбудители туберкулеза – бесцветные.

Метод Пешкова

Окраска по Пешкову проводится для выявления эндоспор грамположительных бактерий. Используют жидкость Карнуа, метиленовый синий, фуксин по Пфейферу (или нейтральный красный).

Результат окрашивания по Пешкову прекрасно микроскопируется:

  • зрелые эндоспоры становятся голубыми;
  • молодые эндоспоры – насыщенно-синие;
  • цитоплазма приобретает красный цвет;
  • хроматин – зерна приобретают фиолетовую окраску.

Окраска микроорганизмов по Романовскому-Гимзе

Метод окраски по Леффлеру позволяет получить зримую картину путем последовательного применения танина и красителя. Также наличие жгутиков может выявить окраска по Морозову:

  • обрабатывают препарат кислотой, при этом жгутики и оболочки разрыхляются;
  • протравливают танином;
  • окрашивают азотнокислым серебром – жгутики и оболочка покрываются толстым слоем препарата и приобретают цвет в гамме от желтого до насыщенно-коричневого.

Кроме того, Леффлер разработал методику окраски дифтерийных бактерий метиленовым синим Леффлера (готовят из спиртового раствора метиленового синего, слабого раствора щелочи и дистиллированной воды). В результате обработки бактериальная палочка приобретает голубой цвет, а гранулы волютина дифтерийных бактерий окрашиваются в темно-синий.

Помимо жгутиков, методики окраски бактерий позволяют определить наличие капсул, для чего применяется методика Бурри-Гинса: последовательная обработка препарата разведенной тушью, спиртом, фуксином Пфейфера. После чего образец промывается водой и высушивается.

Капсулы выглядят как светлые ореолы, расположенные вокруг красных бактерий на темном фоне.

Естественная окраска колоний микроорганизмов

Существует целая группа микроорганизмов, называемая хромогенными бактериями, колонии которых как в природе, так и на искусственных средах окрашены ярко и разнообразно. Цветовая гамма представлена от нежно-лимонного до густого темно-синего и даже черного. Хромогенных бактерий множество – это и кокки, и палочки, и спириллы. Химический состав красителей тоже очень разнообразен.

Независимо от цвета колонии все хромогенные бактерии совершенно бесцветны, окраску обеспечивают капельки, кристаллики или зернышки, расположенные вне клеток и являющиеся отходами жизнедеятельности бактерий. Эти отходы могут растворяться и диффундировать в окружающую среду, что приводит к окрашиванию пространства колонии.

Понятие «хромогенные бактерии» появилось в 1872 году благодаря Ф. Кону. Было выявлено, что бактерии, обладающие способностью к хромогенезу, не являются естественной, а лишь сборной группой, которую объединяет только способность окрашивать среду.

Неоднократно были предприняты попытки классификации хромогенных бактерий, однако успешных предложено не было.

Сегодня применяется классификация, основанная на растворимости пигмента:

  • пигмент водорастворим;
  • пигмент не растворяется в воде, но растворяется в спирте;
  • нерастворимый ни в воде, ни в спирте пигмент.

Данная классификация несовершенна, что объясняется недостатком информации как по природе пигмента, так и по самой функции хромогенеза.

Хромогенных бактерий известно уже очень много, а сортов красителей, которые они производят, намного меньше. Это объясняется тем, что различные хромогенные бактерии производят один и тот же пигмент.

Все бактериальные пигменты делят на 3 большие группы:

  • липохромы;
  • продигиозин;
  • бактериофлуоресцин.

Липохромы

Колонии, выделяющие липохромы, окрашены в цвета от желтого до красного. К ним относятся почти все кокки и в меньшей степени палочки.

  • агрегатная форма – кристаллики;
  • нерастворим в воде;
  • растворим в органических растворителях (спирт, бензин, эфир, сероуглерод и др.);
  • омыляется горячей щелочью;
  • с концентрированной серной кислотой дает синее окрашивание – липоциановая реакция Цопфа.

Продигиозин

Бактерии, выделяющие красный пигмент продигиозин, известны с давних времен как бактерии «чудесной крови».

О них упоминал Пифагор, запрещая своим ученикам есть вареные бобы, которые простояли ночь – на них могла появиться «кровь». В Средние века замечали появление «чудесной крови» на продуктах, когда сначала появляются небольшие кровавые капельки, которые очень быстро растут и прямо заливают продукты кровавым слоем.

Появление «чудесной крови» отмечалось на богатых крахмалом продуктах – хлебе, рисе, поленте, вареном картофеле, бывает на мясе или отварных яйцах, но достаточно редко. Может развиться на молоке, тогда слой сливок окрашивается в красный цвет, а само молоко быстро створаживается.

Бактерии «чудесной крови» не являются патогенными, однако некоторые продукты их жизнедеятельности – токсальбумины – обладают токсическими свойствами.

Физико-химические свойства пигмента:

  • жидкость;
  • малорастворим в воде;
  • растворяется в органических растворителях (спирты, эфир, хлороформ, сероуглерод и другие);
  • при взаимодействии со щелочами образуется оранжево-желтая краска;
  • при воздействии кислот образуется карминовая и далее – фиолетовая краска;
  • солнечный цвет разрушает пигмент в растворах.

Бактериофлуоресцин

Флуоресцирующий пигмент вырабатывают маленькие бактерии-палочки, подвижные за счет жгутика на одном конце, все они не образуют спор.

Большая часть бактерий является сапрофитами и имеет широкий ареал обитания. Колонии обнаруживают зелено-травяную флуоресценцию.

Физико-химические свойства пигмента:

  • в чистом виде не выделен, предположительно является белковым веществом;
  • водорастворим;
  • не растворяется в спиртах, эфирах и бензине;
  • концентрированный раствор имеет бледно-желтый цвет и флуоресцирует голубым цветом;
  • обработка щелочью сдвигает флуоресценцию в зеленый цвет;
  • при добавлении кислоты флуоресценция прекращается.

Кроме трех основных пигментов, были выделены пиоцианин (синий), пиоксантин (красно-бурый), синцианеин (синий) и другие.

Одни бактерии образуют пигмент всегда, другие микроорганизмы выделяют пигмент иногда. Есть бактерии, которые всегда выделяют только один пигмент, а есть бактерии, выделяющие несколько различных пигментов.

Хромобактерии изучены недостаточно хорошо, не выявлены причины, от которых зависит потеря хромобактериями способности выделять пигмент. Такие колонии называют лейкорасой. Однако при дальнейших посевах лейкораса может дать нормальное окрашивающее потомство.

Изучение способности бактерий к хромогенезу представляет большое не только научное, но и практическое значение.

1. На фиксированный мазок нанести карболово-спиртовой раствор генцианового фиолетового через полоску фильт­ровальной бумаги. Через 1-2 мин ее снять, а краситель слить.

2. Нанести раствор Люголя на 1-2 мин.

3. Обесцветить этиловым спиртом в течение 30-60 с до прекращения отхождения фиолетовых струек красителя.

4. Промыть водой.

5. Докрасить водным раствором фуксина в течение 1-2 мин, промыть водой, высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фио­летовый цвет, грамотрицательные - в красный (рис. 2.2.1; на вклейке). В основе этого метода лежит избирательное обесцве­чивание - удаление комплекса генцианового фиолетового с

Йодом под действием спирта. Результат окраски по методу Грама определяется особенностями строения и химического состава клеточной стенки бактерий и зависит от способности удерживать образовавшийся в процессе окраски комплекс ген-цианового фиолетового с йодом.

Фирмикутные бактерии окрашиваются грамположительно, поскольку имеют многослойный пептидогликан, связанный с тейхоевыми кислотами. Последние обусловливают прочную фиксацию красителя и резистентность к обесцвечиванию спир­том. Грациликутные бактерии окрашиваются грамотрица-тельно.

Окраска по методу Грама имеет важное дифференциально-диагностическое значение и широко используется в микробио­логии. К грамположительным бактериям относятся стафило­кокки, стрептококки, коринебактерии дифтерии и др., к грам-отрицательным - гонококки, менингококки, кишечная палоч­ка и др. Некоторые виды бактерий (клостридии, гарднереллы) могут окрашиваться по методу Грама вариабельно в зависимос­ти от возраста культуры, особенностей культивирования и дру­гих факторов, воздействующих на структуру клеточной стенки.

Основная ошибка, допускаемая при окраске по методу Гра­ма, заключается в "переобесцвечивании" мазка этиловым спиртом. Грамположительные бактерии при этом могут утра­чивать первоначальную окраску генциановым фиолетовым и приобретать красный цвет (характерный для грамотрицатель-ных бактерий) в результате последующей докраски мазка фук­сином. Грамотрицательные бактерии в свою очередь могут сохранять сине-фиолетовый цвет генцианового фиолетового. Для правильной окраски следует строго соблюдать технику обесцвечивания.

Окраска кислотоустойчивых бактерий по методу Циля-Ниль­сена

1. На фиксированный мазок нанести карболовый раствор фуксина через полоску фильтровальной бумаги и подо­греть 3-5 мин до появления паров.

2. Снять бумагу, промыть мазок водой.

3. Нанести 5 % раствор серной кислоты или 3 % раствор смеси спирта с хлористоводородной кислотой на 1 -2 мин для обесцвечивания.

4. Промыть водой.

5. Докрасить мазок водным раствором метиленового синего в течение 3-5 мин.

6. Промыть водой, высушить и микроскопировать.

В основе метода лежат протравливание (разрыхление) кле­точной стенки бактерий для усиления поглощения красителя и избирательное обесцвечивание под действием кислоты. Кис-лотоустойчивость бактерий обусловлена особым строением их клеточной стенки с повышенным содержанием липидов: раз-


ветвленных жирных кислот (миколовых кислот), глико- и фос-фолипидов, восков. Клеточная стенка кислотоустойчивых бак­терий имеет очень низкую проницаемость, поэтому они пло­хо воспринимают красители. Раствор карболовой кислоты разрыхляет клеточную стенку и тем самым повышает ее тинк-ториальные свойства, а высокая концентрация красителя и нагревание в процессе окраски усиливают реакцию взаимодей­ствия красителя с бактериальными клетками, которые при этом окрашиваются в красный цвет. При обработке препарата серной кислотой некислотоустойчивые бактерии обесцвечива­ются и в дальнейшем окрашиваются метиленовым синим в голубой цвет, а кислотоустойчивые бактерии остаются окра­шенными фуксином в красный цвет (рис. 2.2.2; на вклейке).

Страница 8 из 91

Для окрашивания бактерий необходимо иметь ряд красящих растворов, желательно в особых склянках с пипетками, на которые надеты резиновые баллончики. Краску при помощи пипетки наливают на препарат так, чтобы весь мазок был покрыт ею. Препарат с краской помещают на подставку для предметных стекол. Такую подставку кладут на чашку или фотографическую ванночку (рис. 14). Если при окрашивании необходимо подогревание, то пользуются специальным пинцетом для предметных стекол (рис. 15). По окончании окрашивания краску смывают струей воды или препарат промывают в сосуде с водой. После промывания препарат оставляют в вертикальном положении для просушивания или сушат между листками фильтровальной бумаги. Если на препарате останется вода, то, соединившись с иммерсионным маслом, она даст эмульсию, мешающую хорошему видению при микроскопии.
Краски
Краски, применяемые для бактериологических исследований, относятся к группе так называемых анилиновых. Но поскольку они получаются не только из анилина, но и из других производных каменноугольного дегтя - бензола, толуола и др., то правильнее называть их каменноугольными красками. Краски эти разделяются на основные и кислые. Термины «кислые» и «основные» только определяют сродство краски к определенной части клетки. Основными красками хорошо окрашиваются ядра и микробы. Кислые краски окрашивают микробов слабее, при окраске же тканей они окрашивают цитоплазму клеток. Наиболее употребительны следующие краски: метиленовый синий, тионин (синие краски), основной фуксин, сафранин и эозин (красные краски), бисмаркбраун, или везувин (коричневая краска), метилгрюн (зеленая краска), метилвиолет, генцианвиолет (фиолетовые краски). Из них только эозин - кислая краска. Она употребляется для некоторых специальных целей.
Все эти краски продаются в виде аморфных или кристаллических порошков, и из них уже готовят красящие растворы.
Приготовление красящих растворов. Исходным материалом почти для всех необходимых рабочих красок являются насыщенные спиртовые растворы, которые следует иметь в запасе и сохранять в склянках с притертыми пробками. Насыщенные спиртовые растворы готовят следующим образом: 10 г сухой краски высыпают во флакон с притертой пробкой, наливают 100 мл 96° спирта (ректификата) и дают настояться в течение нескольких дней, каждый день взбалтывая раствор. Из таких насыщенных растворов готовят спирто-водные пастворы, пригодные для окраски микробов. Наиболее часто употребляются следующие растворы.
Карболовый фуксин (фуксин Циля)
10 мл насыщенного спиртового раствора фуксина 100 мл 5% карболовой кислоты
Разведенный фуксин
10 мл карболового фуксина 90 мл дистиллированной воды
Щелочный метиленовый синий 30 мл насыщенного спиртового раствора синей 100 мл дистиллированной воды 1 мл 1% раствора щелочи
Карболовый генцианвиолет 10 мл насыщенного спиртового раствора генциаивиолета 90 мл 5% карболовой кислоты
Растворы генциаивиолета дают осадки при окрашивании. Вместо генциаивиолета можно пользоваться насыщенными спиртовыми растворами метилвиолета или кристалвиолета. Растворы карболовой кислоты можно брать 1%, а не 5%. Кроме того, для окраски по Граму можно пользоваться 0,25% водным раствором метилвиолета или кристалвиолета без карболовой кислоты. Раствор стоек и осадка не дает.
По методу Синева вместо раствора генцианвиолета применяют кусочки фильтровальной бумаги, предварительно пропитанные спиртовым раствором краски и затем высушенные. Для этого листы фильтровальной бумаги погружают на 1-2 минуты в 1-2% раствор краски в 96° спирту, после чего бумагу высушивают на протянутой веревочке или стеклянных палочках и разрезают на кусочки 2X4 см. Такие бумажки сохраняются в банках с притертой пробкой неограниченное время.
Простые методы окраски микробов. В лабораторной технике пользуются простыми и сложными методами окраски микробов. Простым методом окраски называют окраску препарата одной какой-либо краской. К таким методам относится окраска разведенным фуксином или щелочной метиленовой синей.
Окраска разведенным фуксином. На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на пламени горелки. Затем на охлажденный препарат на 1-2 минут наливают разведенный фуксин. Краску смывают водой и препарат высушивают.
Окраска щелочным метиленовым синим (Леффлера). На предметном стекле готовят мазок и фиксируют его на огне. На остывший мазок наливают метиленовую синь на 2-3 минуты. Краску смывают водой и препарат высушивают. При окраске дифференцируется ядро и цитоплазма, и поэтому при окраске патологического материала (гной, экссудат и т. д.) целесообразнее использовать метиленовый синий.
Сложные методы окраски микробов. При сложных методах окраски микробов на один и тот же препарат воздействуют несколькими растворами красителей. Сложные методы основаны на физико-химическом строении бактериальной клетки и сродстве микробов к определенным краскам. Эти методы окраски имеют важное значение при дифференциации микробов. К сложным методам относится окраска по Граму, Цилю - Нильсену, Нейссеру и т. д.
Окраска микробов по методу Грама. Все микробы по их отношению к окраске по методу Грама делятся на две группы: а) грампозитивные, или грамположительные; б) грамнегативные, или грамотрицательные.
Различное отношение к окраске по Граму зависит от отличий в физическом и химическом строении самих бактерий. Для окраски по классическому методу Грама необходимы следующие растворы:

  1. карболовый генцианвиолет;
  2. раствор Люголя (йода кристаллического 1 г, йодистого калия 2 г и дистиллированной воды 300 мл; йод и йодистый калий смешивают и растворяют в 5 мл воды, а затем добавляют остальную воду);
  3. спирт 96°;
  4. разведенный фуксин.

Техника окраски по Граму. На фиксированный мазок кладут фильтровальную бумагу, по размеру равную сделанному мазку. На эту бумагу наливают раствор генцианвиолета на I-2 минуты. Сливают краску с бумагой и, не промывая препарат водой, наливают на 1- 2 минуты раствор Люголя до почернения мазка. Затем раствор Люголя сливают и на 1/3-1 минуту наливают 96° спирт (при этом препарат надо покачивать). Промывают водой и дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1-2 минуты). Сливают краску, промывают водой, высушивают и микроскопируют.
Видоизмененный способ Грама (по А. Синеву). l.Ha фиксированный мазок накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанную 1% спиртовым раствором кристалвиолета или генцианвиолета.

  1. Наносят на бумагу 2-3 капли воды и оставляют на 2 минуты.
  2. Снимают бумагу пинцетом и наливают раствор Люголя на 1-2 минуты.
  3. Обесцвечивают спиртом (10-30 секунд).
  4. Дополнительно окрашивают разведенным фуксином (1-2 минуты). _

Механизм окраски по Граму . Сущность метода Грама состоит в том, что краска генциан-, метил- или кристалвиолет обладает способностью прочно фиксироваться в бактериальной клетке. В этом случае под действием спирта не наступает обесцвечивание, микроб остается окрашенным в фиолетовый цвет. Это значит, что он грамположительный. Если же в бактериальной клетке краска не будет фиксирована, то под действием спирта микробы обесцвечиваются и воспринимают дополнительную краску - разведенный фуксин. Микробы окрашиваются в розовый цвет, т. е. они будут грамотрицательны (рис. 16 на вклейке).
Окраска кислотоустойчивых микробов. Способы окраски кислотоустойчивых микробов основаны на их способности окрашиваться лишь сильно красящими растворами красок при нагревании. При последующем действии слабых кислот они не обесцвечиваются. Благодаря такой обработке кислотоустойчивые микробы могут быть дифференцированы от других бактерий. Наиболее употребительна окраска по Цилю - Нильсену.
Техника окраски. 1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин, и препарат окрашивают при нагревании до троекратного появления паров, после чего оставляют краску еще на несколько минут и дают препарату остыть.

Рис. 16. Окраска по Граму стафилококка и вибриона.

  1. Сливают краску и промывают препарат водой. ,3- Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (10-30 секунд).
  2. Промывают водой.
  3. Промывают чистым спиртом 10-15 секунд.

6. Спирт смывают водой.
7. Докрашивают синью Леффлера в течение 3-5 минут.

Обесцвечивание препарата можно также произвести 3% раствором солянокислого спирта. При этом методе окраски кислотоустойчивые туберкулезные бактерии окрашиваются в рубиново-красный цвет, а другие, некислотоустойчивые микробы, - в синий цвет (см. рис. 88 на вклейке).
Кислото- и спиртоустойчивость туберкулезных микобактерий объясняется тем, что они имеют в своем составе миколовую кислоту, вступающую в химическое соединение с карболовым фуксином. Это соединение фиксирует краску в микробной клетке, и поэтому палочки не обесцвечиваются.
Окраска спор. В микробиологической практике применяют несколько методов окраски спор (рис. 17 на вклейке).

  1. Способ Пешкова. На краю предметного стекла делают тонкий мазок из культуры бактерий, просушивают на воздухе и фиксируют спирт-эфиром, спирт- формалином или па пламени горелки. На фиксированный препарат наливают синь Леффлера и на пламени горелки доводят до кипения в течение 15-20 секунд. Дают препарату остыть, промывают водой и докрашивают 0,5% водным раствором нейтральрота 30-60 секунд. Краску промывают и препарат высушивают. Споры окрашиваются в голубой или синий цвет, вегетативные формы - в розовый.
  2. Способ Гансена. Препарат фиксируют на пламени горелки 5-7 раз, на фиксированный препарат кладут кусочек фильтровальной бумаги, на которую наносят карболовый фуксин, и на пламени горелки доводят до кипения. Препарату дают слегка остыть, доливают карболовый фуксин и снова кипятят. Затем, долив карболовый фуксин, кипятят третий раз. Препарату дают остыть, промывают водой, обесцвечивают 5% раствором серной кислоты в течение 20-30 секунд и докрашивают синью в течение 3-5 минут. Споры, стойко прокрасившиеся фуксином, - красные, а вегетативные тела бактерий, обесцветившиеся в результате воздействия серной кислоты, окрашиваются метиленовым синим в синий цвет (см. рис. 101 на вклейке).

Рис. 18. Капсулы у пневмококка.


Рис. 17. Споры бацилл.

Рис. 19. Капсулы у бактерий.

Окраска капсул. Окраска капсул удается с помощью обычных красок, метиленовой синей или разведенным фуксином, причем лучше всего в мазках из органов или тканевой жидкости (рис. 18 на вклейке). В этих случаях тела микробов и фон (клетки органа) окрашены в синий или красный цвет, капсула же видна как бесцветная каемка, окружающая микроб.
Метод Гинса. При окраске капсул в чистой культуре микробов пользуются методом Гинса.
Техника окраски. 1. На предметное стекло наносят каплю чертежной туши и разбавляют равным количеством воды.

  1. В полученную каплю вносят небольшое количество агаровой или бульонной культуры бактерий и смешивают петлей.
  2. Ребром шлифовального стекла касаются капли туши и, когда тушь растекается по ребру стекла, делают мазок, как мазок из крови.
  3. Мазок фиксируют в концентрированном растворе сулемы 1 минуту или на пламени горелки.
  4. Промывают водой (при фиксации в сулеме).
  5. Окрашивают карболовым фуксином или синью 5-10 минут.
  6. Смывают водой, сушат и микроскопируют.

Капсулы не окрашиваются, но благодаря применению туши представляются резко очерченными, тела же бактерий окрашены и лежат внутри капсулы (рис. 19, на вклейке).
Окраска метахроматических зерен (волютина) по Нейссеру. Необходимо приготовить две краски: а) уксуснокислую синь Нейссера, б) краску везувин, или бисмаркбраун.
Синь Нейссера состоит из двух растворов:
Раствор А
Метиленового синего 0,1 г Этилового спирта 2 мл Ледяной уксусной кислоты 5 мл Дистиллированной воды 100 мл
Раствор Б
Кристалвиолета 1 г
Этилового спирта (абсолютного) 10 мл Дистиллированной воды 300 мл
Растворы А и Б смешивают непосредственно перед окраской в отношении 2:1.
Краска везувин, или бисмаркбраун, получается путем растворения 1 г порошка в 300 мл кипящей дистиллированной воды.
Техника окраски. На фиксированный препарат наносят синьку Нейссера на 0,5-1 минуту, краску смывают водой и дополнительно окрашивают раствором везувина 1-3 минуты. После этого препарат промывают водой, сушат и микроскопируют. По этому способу бактерии окрашиваются в светло-коричневый цвет, а метахроматические зерна - в синий (рис. 83 на вклейке).
В некоторых лабораториях приведенный классический метод Нейссера несколько видоизменяют. Уксуснокислую синь наносят на 4-5 минут, промывают водой. Затем на препарат наливают на V2-1 минуту раствор Люголя, сливают его и докрашивают везувином в течение 1-V2 минуты.
Окраска по Романовскому-Гимзе. Краска Гимзы - смесь азура (органическая краска, получаемая из метиленового синего), эозина и метиленовой сини. Будучи в растворе синего цвета, она окрашивает клеточную цитоплазму в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь, капсулы бактерий - в красно-фиолетовый цвет.
Окраска по Романовскому-Гимзе является одним из основных методов при изучении морфологии простейших, спирохет, а также при исследовании форменных элементов крови.
Способ применения. К 10 мл дистиллированной воды нейтральной или слабощелочной реакции непосредственно перед окраской препарата прибавляют 10 капель краски и тотчас же наливают на фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1 час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и исследуют. Если поместить препарат с краской в термостат при 37°, то окрашивание происходит быстрее (30-40 минут). Результаты окрашивания зависят от свойств воды, поэтому следует проверять ее реакцию.
Окраска риккетсий по Здродовскому. Тонкий мазок фиксируют на пламени горелки. Окраску производят разведенным карболовым фуксином (10-15 капель фуксина на 10 мл бидистиллированной воды) в течение 5 минут. Окрашенный препарат промывают водой, а затем обесцвечивают в растворе органической или минеральной кислоты (0,5% лимонная кислота, 0,01% соляная кислота) в течение 2-3 секунд. Затем препарат промывают водой и докрашивают 0,5% раствором метиленовой сини в течение 1/3 минуты. В препарате на синем фоне будут видны окрашенные в красный цвет риккетсии (рис. 116 на вклейке).

Исследование микроорганизмов в живом состоянии

Так как методы обнаружения жгутиков трудны, а определение подвижности микробов служит целям определения их вида, то в повседневной лабораторной практике для определения подвижности пользуются наблюдением бактерий в живом состоянии - в раздавленной или висячей капле.
Раздавленная капля. На середину предметного стекла наносят петлей или пипеткой каплю исследуемого материала. Эту каплю накрывают покровным стеклом, осторожно накладывая его пинцетом, чтобы в жидкости не образовалось пузырьков воздуха. Правильно сделанная капля заполняет все пространство между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за края покровного стекла. Если требуется рассматривать препарат продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают вазелином.
Висячая капля. Каплю исследуемого материала наносят на середину покровного стекла. Затем покровное стекло быстро поворачивают каплей вниз и накладывают на предметное стекло с углублением («лункой») в середине. Капля должна свободно свисать в углубление, не соприкасаясь с его дном и краями (рис. 20). Края выемки на предметном стекле следует предварительно смазать вазелином. Таким образом, капля оказывается герметически закрытой во влажной камере и защищенной от высыхания.
Определение подвижности у микробов используется при лабораторной диагностике дизентерии, холеры, брюшного тифа и других заболеваний.
При исследовании живых микробов следует отличать активную подвижность бактерий, свидетельствующую о наличии у них невидимых жгутиков, от пассивного молекулярного (броуновского) движения, свойственного всем взвешенным в жидкости мелким частицам (форменные элементы, зернышки, пылинки, микробы как лишенные жгутиков, так и убитые).

Рис. 20. Висячая капля.

Исследование в темном поле зрения. Движение бактерий и спирохет можно наблюдать в микроскопе, который отличается от обычного применением яркого бокового освещения, в силу чего получается изображение светящегося объекта на темном фоне. Принцип темного поля основан на том, что падающие сбоку световые лучи отклоняются плотными частицами (в частности, бактериями) и последние благодаря этому представляются глазу наблюдателя ярко светящимися. Боковое освещение в микроскопе можно получить, заменив обычный осветитель специальным конденсором с затемнением в центре. Такой конденсор задерживает все центральные лучи света и пропускает лишь периферические. Техника исследования заключается в следующем. На предметное стекло наносят каплю исследуемого материала и осторожно накрывают покровным стеклом, чтобы не было пузырьков воздуха. Затем на поверхность конденсора помещают каплю воды или кедрового масла и предметное стекло с препаратом кладут на эту каплю.

(или метод Грама) — эмпирически выведенный метод различения бактерий с помощью окрашивания их определенным методом на две большие группы: Грамположительные и Грамотрицательные), различающихся химическими и физическими свойствами их клеточной стенки.

Этимология

Метод называется в честь его изобретателя, датского ученого Ганса Христиана Грама (1853-1938), который разработал этот метод в 1884 году чтобы различить бактерии Pneumococcus и Klebsiella pneumoniae.

Использование

Окраска по Граму — одна из самых полезных красящих процедур в лабораторных исследованиях в микробиологии. Процедура широко используется как инструмент для различения Грамм-отрицательных и Грам-положительных бактерий, обычно являются первым шагом в определении идентичности специфического бактериального образца.

В медицине окрашивания по Граму выполняется при анализе крови или биопсии, когда подозревается инфекция. Этот метод гораздо быстрее, чем культура, и особенно важен, когда определение типа инфекции необходимо для прогноза и выбора метода лечения. Например, при диагностике цереброспинальной жидкости менингитом и жидкости суставов на септический артрит.

При анализе, например, Коки и спороносные формы бактерий, а также дрожжи — грам-положительные и окрашиваются в иссиня-черный (темно-синий) цвет, большинство других бактерий — грамотрицательные и окрашиваются в красный цвет, ядра клеток эукариот приобретают ярко красного цвета, а цитоплазма — розового.

Техника проведения окрашивания

Окраска по Граму относится к сложному способу окрашивания, когда на мазок влияют двумя красителями, из которых один является основным, а другой — дополнительным. Кроме красящих веществ при сложных способах окраски применяют обезбарвлюючи вещества: спирт, кислоты и др. Для окраски по Граму чаще используют красители трифенилметанового группы: генциановый, метиловый фиолетовый или кристалл виолет. Грам-положительные (грамм (+)) микроорганизмы дают прочное соединение с указанными красителями и йодом. При этом они не обесцвечиваются при воздействии на них спиртом, в результате чего при дополнительном окраске фуксином Грамм (+) микроорганизмы не меняют сначала присоединен фиолетовый цвет.

Грамотрицательные (грамм (-)) микроорганизмы образуют с основными красителями и йодом соединения, легко разрушается под действием спирта. В результате микробы обесцвечиваются и потом окрашиваются фуксином, приобретая красного цвета.

Подготовка материала для окраски

Материал исследуемого распределяют тонким слоем по поверхности хорошо обезжиренного стекла. Приготовленный мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют.

Фиксация

При фиксации мазок закрепляется на поверхности стекла, и поэтому при дальнейшем окрашивании препарата клетки не смываются. Кроме того, убиты микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые. Различают физический способ фиксации, в основу которого положена действие высокой температуры на клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации Стекло с препаратом берут пинцетом и плавным движением проводят 2-3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют таким приемом: свободную от мазка поверхность стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильной фиксации стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущение ожога (70-80 ° С).

Химический способ фиксации Для фиксации мазков применяют метиловый спирт, ацетон, смесь Никифорова (смесь этилового спирта 96% и наркозного эфира в соотношении 1: 1), жидкость Карнуа (этилового спирта 96% — 60%, хлороформа 30%, ледяной уксусной кислоты 10 %). Стекло с высушенным мазком погружают в стакан с фиксирующей веществом на 10-15 минут и затем высушивают на воздухе.

Процесс окрашивания

  1. На фиксированный мазок наливают один из основных красителей на 2-3 минуты. Чтобы избежать осадка красят через фильтровальную бумагу.
  2. Сливают краску, аккуратно удаляют фильтровальную бумагу. Мазок заливают на 1-2 мин раствором Люголя или йодистым раствором, по Граму (водный раствор йодида калия и кристаллического йода в соотношении 2: 1) в почернение препарата.
  3. Раствор сливают, мазок прополаскивают 96 ° этиловым спиртом или ацетоном, наливая и сливая его, пока мазок НЕ обесцветится и жидкость стекает, не станет чистой (примерно 20-40-60 секунд).
  4. Тщательно промывают стекла в проточной или дистиллированной воде 1-2 мин.
  5. Для выявления грамотрицательных бактерий препараты дополнительно окрашивают фуксином или сафранина (2-5 мин).
  6. Промывают в проточной воде и высушивают фильтровальной бумагой.

    окрасить мазок генцианвиолетом (2 минуты,через фильтровальную бумагу);

    бумагу удалить, оставшуюся краску слить;

    окрасить мазок раствором Люголя (1 минута);

    раствор Люголя слить и нанести несколько капель чистого 96% спирта (30-40 секунд, осторожно покачивать стекло);

    тщательно смыть спирт водой;

    окрасить водным фуксином (2 минуты);

    промыть водой и высушить.

Грам-положительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, Грам-отрицательные – вкрасный Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивые микроорганизмы обладают выраженной к неорганическим кислотам, спиртам, щелочам. Это связано с наличием в клеточной стенке и мембране сравнительно большого количества липидов. Бактерии этой группы очень плохо окрашиваются обычными способами, поэтому используют концентрированные растворы с подогревом. При последующей кратковременной обработке кислотой клетки, воспринявшие краску, не обесцвечиваются. Это позволяет отличить кислотоустойчивые бактерии. Их окрашивают по методу Циля-Нильсена, который разработан с учетом все указанных особенностей Окраска по Цилю-Нильсену. Методика:

    нанести несколько капель карболового фуксина на фиксированный мазок. Покрытый фильтровальной бумагой, и подогреть до появления паров (3-5 минут);

    бумагу снять, мазок охладить и обесцветить 3% серной кислотой или 3% солянокислым спиртом (3-4 секунды);

    тщательно промыть водой;

    окрасить дефферовской синькой (3-5 минут);

    промыть водой и высушить.

Окаска спор. Зрелая спора с трудом поддается окрашиванию из-за низкой проницаемости стенки. При окраске по Граму спорообразующей культуры краска воспринимается только вегетативной частью микроба, а спора остается бесцветной. Проницаемость ее клетки резко увеличивается после обработки горячей соляной кислотой или при испольщовании концентрированного раствора краски в подогревом. Восприняв краску, спора при последующей обработке кислотой не обесцвечивается, в то время как вегетативные клетки немедленно отдают краску. Метод Ожешко.

    нанести несколько капель 0,5% соляной кислоты на нефиксированный мазок и нагреть до появления паров (2-3 минуты);

    слить кислоту, промыть водой, высушить;

    зафиксировать в пламени;

    окрасить по методу Циля-Нильсена (при этом споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий). Часто для окраски спор используют только метод Циля-Нильсена.

Окраска включения волютина (по Нейссеру).

    Окрасить мазок уксуснокислой синькой Нейссера (2-3 минуты);

  • Окрасить раствором Люголя (30 секунд);

    Слить раствор Люголя и окрасить везувином (1 минута)

    Промыть препарат и высушить

Цитоплазма клетки, имеющая кислую реакцию, принимает желтый цвет. Зерна волютина – темно-синие, почти черные. Окраска по Бурри (обнаружение капсул).

Для обнаружения капсул используют негативную окраску, т.к. окрашивается пространство между бактериями. Таким образом, образуется темное поле с не окрашенными бактериями.

    Смешать на предметном стелке немного капсульной культуры и каплю разведенной (1:9) туши;

    Высушить на воздухе и бактериоскопировать.

Модификация по Бурри-Гинсу включает создание фона краской конгорот, последующую фиксацию в 5% растворе соляной кислоты, дополнительную окраску водным фуксином. В результате – общий фон темный, капсулы бесцветны, сами бактерии – красные.

№6 Устройство светового микроскопа и техника иммерсионной микроскопии.