Микроскопические методы исследования. Микроскопия. Методы микроскопии

Основным методом изучения биологических микрообъектов являются световая и электронная микроскопия, которые широко используются в экспериментальной и клинической практике.

Микроскопирование - главный метод изучения микрообъектов, используемый в биологии более 300 лет. Для изучения гистологических препаратов применяют разнообразные виды световых микроскопов и электронные микроскопы. С момента создания и применения первых микроскопов они постоянно совершенствовались. Современные микроскопы представляют собой сложные оптические системы, обладающие высокой разрешающей способностью. Размер самой маленькой структуры, которую можно видеть с помощью микроскопа, определяется наименьшим разрешаемым расстоянием (d), которое в основном зависит от длины волны света (λ) и длины волн электромагнитных колебаний потока электронов и др. Эта зависимость приближенно определяется формулой d = λ/2. Таким образом, чем меньше длина волны, тем меньше разрешаемое расстояние, и тем меньшие по размерам микроструктуры можно видеть в препарате.

Световая микроскопия. Для изучения гистологических микрообъектов применяют обычные световые микроскопы и их разновидности, в которых используются источники света с волнами различной длины. В обычных световых микроскопах источником освещения служит естественный или искусственный свет (рис. 2.1). Минимальная длина волны видимой части спектра примерно 0,4 мкм. Следовательно, для обычного светового микроскопа наименьшее разрешаемое расстояние приблизительно составляет 0,2 мкм, а общее увеличение (произведение увеличения объектива на увеличение окуляра) может быть 1500-2500.

Таким образом, с помощью светового микроскопа можно увидеть не только отдельные клетки размером от 4 до 150 мкм, но и их внутриклеточные структуры - органеллы, включения. Для усиления контрастности микрообъектов применяют их окрашивание.

Ультрафиолетовая микроскопия. Это разновидность световой микроскопии. В ультрафиолетовом микроскопе используют более короткие ультрафиолетовые лучи с длиной волны около 0,2 мкм. Разрешаемое расстояние здесь в 2 раза меньше, чем в обычных световых микроскопах, и составляет приблизительно 0,1 мкм. Полученное в ультрафиолетовых лучах невидимое глазом изображение преобразуется в видимое с помощью регистрации на фотопластинке или путем применения специальных устройств (люминесцентный экран, электронно-оптический преобразователь).

Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия. Явления флюоресценции заключаются в том, что атомы и молекулы ряда веществ, поглощая коротко-

Рис. 2.1. Микроскопы для биологических исследований:

а - световой биологический микроскоп «Биолам-С»: 1 - основание; 2 - ту-бусодержатель; 3 - наклонный тубус; 4 - окуляр; 5 - револьвер; 6 - объективы; 7 - столик; 8 - конденсор с ирисовой диафрагмой; 9 - винт конденсора; 10 - зеркало; 11 - микрометрический винт; 12 - макрометрический винт; б - электронный микроскоп ЭМВ-100АК с автоматизированной системой обработки изображений: 1 - колонка микроскопа (с электронно-оптической системой и камерой для образцов); 2 - пульт управления; 3 - камера с люминесцентным экраном; 4 - блок анализа изображений; 5 - датчик видеосигнала; в - конфокальный микроскоп: 1 - световой микроскоп; 2 - регистратор изображения (фотоэлектронный умножитель);

3 - сканирующее устройство для перемещения светового луча по оси X, Y, Z;

4 - блок питания и стойка управления лазерами; 5 - компьютер для обработки изображений

волновые лучи, переходят в возбужденное состояние. Обратный переход из возбужденного состояния в нормальное происходит с испусканием света, но с большей длиной волны. В флюоресцентном микроскопе в качестве источников света для возбуждения флюоресценции применяют ртутные или ксе-ноновые лампы сверхвысокого давления, обладающие высокой яркостью в области спектра 0,25-0,4 мкм (ближние ультрафиолетовые лучи) и 0,4-0,5 мкм (сине-фиолетовые лучи). Длина световой волны флюоресценции всегда больше длины волны возбуждающего света, поэтому их разделяют с помощью светофильтров и изучают изображение объекта только в свете флюоресценции. Различают собственную, или первичную, и наведенную, или вторичную, флюоресценцию. Любая клетка живого организма обладает собственной флюоресценцией, однако она часто бывает чрезвычайно слабой.

Первичной флюоресценцией обладают серотонин, катехоламины (адреналин, норадреналин), содержащиеся в нервных, тучных и других клетках, после фиксации тканей в парах формальдегида при 60-80 °С (метод Фалька).

Вторичная флюоресценция возникает при обработке препаратов специальными красителями - флюорохромами.

Существуют различные флюорохромы, которые специфически связываются с определенными макромолекулами (акридиновый оранжевый, родамин, флюоресцеин и др.). Например, при обработке препаратов акридиновым оранжевым ДНК и ее соединения в клетках имеют ярко-зеленое, а РНК и ее производные - ярко-красное свечение. Существует много красителей, с помощью которых можно выявить белки, липиды, внутриклеточные ионы кальция, магния, натрия и др. Таким образом, спектральный состав излучения несет информацию о внутреннем строении объекта и его химическом составе. Вариант метода флюоресцентной микроскопии, при котором и возбуждение, и излучение флюоресценции происходят в ультрафиолетовой области спектра, получил название метода ультрафиолетовой флюоресцентной микроскопии.

Для повышения контрастности флюорохромированных объектов применяется конфокальный вариант оптического микроскопа (см. рис. 2.1, в). В качестве освещения используется пучок монохроматического света малого диаметра, который создает лазерный источник. В каждый момент времени в фокусе микроскопа находится небольшой участок (объем) клетки. Пучок света перемещается по объекту (сканирует объект по осям X, Y, Z). При каждом перемещении пучка света по одной из линий сканирования получается информация об исследуемой структуре, находящейся в данной точке (объеме) по линии сканирования (оптическом срезе клетки), например о локализации белков в составе микротрубочек в клетке. Вся полученная информация от каждой точки сканирования клетки передается на компьютер, объединяется с помощью специальной программы и выдается на экран монитора в виде контрастного изображения. С помощью данного метода микроскопии получается информация о форме клеток, цитоскеле-те, структуре ядра, хромосом и др. С помощью программы компьютер на основе полученной информации по каждой линии сканирования создает объемное изображение клетки, что позволяет рассматривать клетку под разными углами зрения.

Фазово-контрастная микроскопия. Этот метод служит для получения контрастных изображений прозрачных и бесцветных живых объектов, невидимых при обычных методах микроскопирования. Метод основан на том, что свет, проходя структуры с различным коэффициентом преломления, изменяет свою скорость. Используемая конструкция оптики микроскопа дает возможность преобразовать не воспринимаемые глазом фазовые изменения прошедшего через неокрашенный препарат света в изменения его амплитуды, т. е. яркости получаемого изображения. Метод фазового контраста обеспечивает контрастность изучаемых неокрашенных структур за счет специальной кольцевой диафрагмы, помещаемой в конденсоре, и так называемой фазовой пластинки, находящейся в объективе. Разновидностью метода фазового контраста является метод фазово-темнопольного контраста, дающий негативное по сравнению с позитивным фазовым контрастом изображение.

Микроскопия в темном поле. В темнопольном микроскопе только свет, который дает дифракцию (огибание волнами) структур в препарате, достигает объектива. Происходит это благодаря наличию в микроскопе специального конденсора, который освещает препарат строго косым светом; лучи от осветителя направляются сбоку. Таким образом, поле выглядит темным, а мелкие частицы в препарате отражают свет, который далее попадает в объектив. В клинике этот метод применяют для изучения кристаллов в моче (мочевая кислота, оксалаты), для демонстрации спирохет, в частности Treponema pallidum, вызывающей сифилис, и др.

Интерференционная микроскопия. Разновидностями фазово-контрастного микроскопа являются интерференционный микроскоп, который предназначен для количественного определения массы ткани. Дифференциальный интерференционный микроскоп (с оптикой Номарского) используют для изучения рельефа поверхности клеток и других биологических объектов.

В интерференционном микроскопе пучок света от осветителя разделяется на два потока: один проходит через объект и изменяется по фазе колебания, второй идет, минуя объект. В призмах объектива оба пучка накладываются друг на друга. В результате строится изображение, в котором участки микрообъекта разной толщины и плотности различаются по степени контрастности. Проведя количественную оценку изменений, определяют концентрацию и массу сухого вещества.

Фазово-контрастный и интерференционный микроскопы позволяют изучать живые клетки. В них используется интерференция, возникающая при комбинации двух наборов волн и создающая изображение микроструктур. Преимуществом фазово-контрастной, интерференционной и темно-польной микроскопии является возможность наблюдать клетки в процессе движения и митоза. При этом регистрация движения клеток может производиться с помощью цейтраферной (покадровой) микровидеосъемки.

Поляризационная микроскопия. Поляризационный микроскоп является модификацией светового микроскопа, в котором установлены два поляризационных фильтра: первый (поляризатор) - между пучком света и объектом, а второй (анализатор) - между линзой объектива и глазом. Через первый фильтр свет проходит только в одном направлении, второй фильтр имеет главную ось,

которая располагается перпендикулярно первому фильтру, и он не пропускает свет. Получается эффект темного поля. Структуры, содержащие продольно ориентированные молекулы (коллаген, микротрубочки, микрофиламенты), и кристаллические структуры, обладают свойством вращать ось световых лучей, исходящих из поляризатора. При изменении оси вращения данные структуры проявляются как светящиеся на темном фоне. Способность кристаллов или паракристаллических образований к раздвоению световой волны на обыкновенную и перпендикулярную к ней называется двойным лучепреломлением. Такой способностью обладают фибриллы поперечнополосатых мышц.

Электронная микроскопия. Большим шагом вперед в развитии техники микроскопии было создание и применение электронного микроскопа (см. рис. 2.1). В электронном микроскопе используется поток электронов с волнами более короткими, чем в световом микроскопе. При напряжении 50 000 В длина волны электромагнитных колебаний, возникающих при движении потока электронов в вакууме, равна 0,0056 нм. Теоретически рассчитано, что разрешаемое расстояние в этих условиях может быть около 0,002 нм, или 0,000002 мкм, т. е. в 100 000 раз меньше, чем в световом микроскопе. Практически в современных электронных микроскопах разрешаемое расстояние составляет около 0,1-0,7 нм.

В гистологии используются трансмиссионные (просвечивающие) электронные микроскопы (ТЭМ), сканирующие (растровые) электронные микроскопы (СЭМ) и их модификации. С помощью ТЭМ можно получить лишь плоскостное изображение изучаемого микрообъекта. Для получения пространственного представления о структурах применяют СЭМ, способные создавать трехмерное изображение. Растровый электронный микроскоп работает по принципу сканирования электронным микрозондом исследуемого объекта, т. е. последовательно «ощупывает» остро сфокусированным электронным пучком отдельные точки поверхности. Такое исследование объекта называется сканированием (считыванием), а рисунок, по которому движется микрозонд, - растром. Полученное изображение выводится на телевизионный экран, электронный луч которого движется синхронно с микрозондом.

Главными достоинствами растровой электронной микроскопии являются большая глубина резкости, широкий диапазон непрерывного изменения увеличения (от десятков до десятков тысяч раз) и высокая разрешающая способность. Современными вариантами приборов для изучения поверхности объекта является атомно-силовой микроскоп и сканирующий туннельный микроскоп.

Электронная микроскопия с использованием метода замораживания - скалывания применяется для изучения деталей строения мембран и межклеточных соединений. Для изготовления сколов клетки замораживают при низкой температуре (-160 °С). При исследовании мембраны плоскость скола проходит через середину бислоя липидов. Далее на внутренние поверхности полученных половинок мембран напыляют металлы (платина, палладий, уран), изучают их с помощью ТЭМ и микрофотографии.

Метод криоэлектронной микроскопии. Быстро замороженный тонкий слой (около 100 нм) образца ткани помещают на микроскопическую решетку и исследуют в вакууме микроскопа при -160 °С.

Метод электронной микроскопии «замораживание - травление» применяют для изучения внешней поверхности мембран клеток. После быстрого замораживания клеток при очень низкой температуре блок раскалывают лезвием ножа. Образующиеся кристаллы льда удаляют путем возгонки воды в вакууме. Затем участки клеток оттеняют, напыляя тонкую пленку тяжелого металла (например, платины). Метод позволяет выявлять трехмерную организацию структур.

Таким образом, методы замораживания - скалывания и замораживания - травления позволяют изучать нефиксированные клетки без образования в них артефактов, вызываемых фиксацией.

Методы контрастирования солями тяжелых металлов позволяют исследовать в электронном микроскопе отдельные макромолекулы - ДНК, крупных белков (например, миозин). При негативном контрастировании изучают агрегаты макромолекул (рибосомы, вирусы) либо белковые филаменты (актиновые нити).

Электронная микроскопия ультратонких срезов, полученных методом криоультрамикро-томии. При этом методе кусочки тканей без фиксации и заливки в твердые среды быстро охлаждают в жидком азоте при температуре -196 °С. Это обеспечивает торможение метаболических процессов клеток и переход воды из жидкой фазы в твердую. Далее блоки режут на ультрамикротоме при низкой температуре. Такой метод приготовления срезов обычно используют для определения активности ферментов, а также для проведения иммунохимических реакций. Для выявления антигенов применяют антитела, связанные с частицами коллоидного золота, локализацию которого легко выявить на препаратах.

Методы сверхвысоковольтной микроскопии. Используют электронные микроскопы с ускоряющим напряжением до 3 000 000 В. Преимущество этих микроскопов в том, что они позволяют исследовать объекты большой толщины (1-10 мкм), так как при высокой энергии электронов они меньше поглощаются объектом. Стереоскопическая съемка позволяет получать информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким разрешением (около 0,5 нм).

Микроскопические методы исследования – это способы изучения очень мелких, неразличимых невооруженным глазом объектов с помощью микроскопов. Широко применяются в бактериологических, гистологических, цитологических и других исследованиях.

Микроскопия - один из главных методов диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний, позволяющий определить вид возбудителя по форме, размерам, строению оболочки, цитоплазмы, ядра, взаиморасположению и способности окрашиваться определенными красителями; обнаружить яйца и личинки гельминтов, их фрагментов, вегетативных и цистных форм патогенных простейших.

Микроскоп – это оптический прибор, имеющий как минимум двухступенчатое увеличение. И одно из них принадлежит окуляру, который играет роль лупы. Только в отличие от бытовой лупы, окуляр имеет постоянное увеличение, его положение в микроскопе определено и жестко закреплено стандартом (высота окуляра).

Любой оптический микроскоп имеет базовые узлы, функциональное назначение которых не меняется от типа, класса прибора или страны производителя. Разница только в конструкторском и технологическом решениях, предложенных специалистами фирм-разработчиков, а также уровне мирового научно-технического прогресса. И как бы микроскоп не назывался – световой, цифровой, видеомикроскоп, фотомикроскоп, лазерный сканирующий микроскоп, анализатор изображения – в его основе будет базовый световой микроскоп, принцип которого был разработан еще Левингуком, Ньютоном, Карл Цейсом, Эрнстом Аббе.

Микроскоп – это оптико-механо-электрический прибор, объединяющий в себе три функциональные части:
· функция воспроизводящей системы – воспроизвести (создать, сформировать) изображение объекта таким образом, чтобы оно как можно точнее передавало детали объекта с соответствующим разрешением, увеличением, контрастом и цветопередачей;
· функция визуализирующей системы – передать изображение объекта, созданное воспроизводящей системой микроскопа, таким образом, чтобы оно с небольшим дополнительным увеличением (или без него) было видно достаточно резко на сетчатке глаза, фотопленке или пластинке, на экране телевизора или монитора компьютера;
· функция осветительной системы – создать световой поток, позволяющий осветить объект таким образом, чтобы воспроизводящая система микроскопа предельно точно могла выполнить свою основную функцию. При этом совместная работа обоих систем должна обеспечивать визуализацию изображения с использованием физико-химических свойств объекта.

Важнейшей характеристикой каждого объектива микроскопа является его разрешающая способность. Разрешающей способностью называется расстояние между двумя точками, при котором они видны раздельно (т.е. не сливаются в одну).

Для полного использования разрешающей способности иммерсионного объектива необходимо выполнять следующие основные правила:
1) Конденсор осветительного аппарата должен быть поднят до отказа (до уровня предметного столика).
2) Диафрагма конденсора полностью открыта.

Во всех без исключения случаях работа ведется с применением встроенной подсветки или плоского зеркала, так как конденсор рассчитан на работу с параллельными пучками света.
Одной из важных характеристик объектива является его свободное рабочее расстояние, т.е. расстояние между верхней поверхностью препарата и нижней поверхностью фронтальной линзы объектива при наведенном на фокус объективе. Эти расстояния следующие:
для объектива с увеличением 10х – 0,25 мм;
для объектива с увеличением 40х – 0,65 мм;
для объектива с увеличением 100х – 1,25 мм.
Знание этих расстояний необходимо для того, чтобы быстро сфокусировать объектив на препарат.

Классификация микроскопов

Микроскопы по объекту исследования можно разделить на следующие основные виды:
- микроскопы плоского поля – это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в двумерном пространстве – двумерное изображение. Объекты исследования – тонкие, в среднем, толщиной от 10 мм до 0,1 мм, просматриваемый слой от 1 мм до 0,001 мм. В этих микроскопах возможно наблюдение объемного изображения в пределах 100-200 мкм по высоте за счет особых способов освещения.
- стереоскопические микроскопы - это микроскопы, оптическая схема которых обеспечивает воспроизведение объекта в трехмерном пространстве – объемное, трехмерное изображение. Объекты исследования – габаритные, в среднем, толщиной от 100 мм до 1 мм, просматриваемый слой по высоте/глубине – от 50 мм до 0,5 мм, и плоские.
Конструктивно микроскопы могут быть выполнены в двух вариантах:
- прямые микроскопы (классическое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена сверху объекта. Это относится к микроскопам плоского поля и стереомикроскопам.
- инвертированные микроскопы (перевернутое построение схемы) – наблюдательная часть микроскопа расположена снизу объекта. Это относится только к микроскопам плоского поля.

По построению изображения микроскопы можно разделить следующим образом:
- микроскопы светлого поля – на светлом фоне более темное изображение объекта. Освещение: обычный прямо проходящий свет.
- микроскопы с методом косого освещения – на сером фоне контрастное изображение объекта с неровным по толщине контуром. Освещение: обычный прямо проходящий свет частично перекрывается до того, как попадает объект.
- микроскопы с методом темного поля – на темном фоне более светлое изображение объекта или ярко блестящий контур объекта. Освещение:
а) в микроскопах проходящего света – обычный прямо проходящий свет полностью перекрывается до того, как попадает на объект;
б) в микроскопах отраженного света - обычный свет, проходя через кольцевую диафрагму с непрозрачным диском, по размеру перекрывающим выходной зрачок объектива.
- микроскопы с методом фазового контраста – дают возможность с максимальной степенью визуализации и детальности наблюдать на сером фоне более темное «объемное» изображение объекта, окруженное по контуру светлой полосой; при негативном (темнопольном) фазовом контрасте картина обратная. Освещение: обычный прямо проходящий свет перекрывается, но в два этапа – часть света до объекта, а затем после объекта прошедшая часть света перекрывается с ослаблением. При этом свет в виде светового кольца определенной площади проходит через объект, а затем после объекта – через полупрозрачное кольцо в объективе.
Кроме того в парке микроскопов имеются специализированные микроскопы:
- люминесцентные микроскопы – обеспечивают возможность наблюдения на темном фоне свечения объектов. Освещение: обычный прямо падающий свет определенной длины волны попадает на объект, изображение объекта строится в другой длине волны; выделение соответствующих областей спектра происходит с помощью сложной системы блоков интерференционных светофильтров.
- поляризационные микроскопы – на сером или темном фоне разноцветное, четкое или контрастное изображение. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью анализатора происходит выделение из структуры изображения тех элементов, которые связаны с анизотропией объекта.
- микроскопы дифференциально-интерференционного контраста или интерференционного контраста – на однотонном цветном фоне яркое цветное «объемное» изображение или изображение того же цвета, что и фон, с окантовкой из другого цвета. Освещение: обычный прямо проходящий свет с помощью поляризатора в осветительной системе превращается в линейно-поляризованный свет, после объекта с помощью специальной призмы и анализатора происходит создание объемного цветного контрастного изображения.
- ультрафиолетовые и инфракрасные микроскопы – освещение и наблюдение объекта с помощью электронно-оптических преобразователей вне видимого диапазона: до 400 нм и свыше 700 нм.

- лазерные микроскопы - освещение и наблюдение объекта с помощью лазерного излучения (смотрите пример ниже).

Порядок работы со световыми микроскопами
· Проверить состояние осветительного аппарата: поднять конденсор, открыть его диафрагму, включить питание и для установки интенсивности освещения медленно повернуть ручку настройки яркости, в случае отсутствия встроенной подсветки, поставить плоское зеркало.
· Поместить на столик микроскопа исследуемый препарат и установить в фокусе сухой объектив (10х) на расстояние несколько меньше свободного рабочего расстояния.
· Глядя в окуляр, произвести предварительную установку освещения с помощью ручки настройки яркости (или вращая зеркалом).
· Медленно поднимая тубус макровинтом, добиться резкого изображения препарата.
· Поставив сухой (40х) или иммерсионный (100х) объектив, опускать тубус микроскопа под контролем глаза, глядя сбоку. Опустить объектив на расстояние меньше свободного рабочего и, глядя в окуляр, макровинтом медленно поднимать тубус до тех пор, пока не появится мелькание препарата. Точная установка достигается с помощью микровинта. Не следует делать микровинтом более половины оборота в одну или другую сторону.

Микроскопия неокрашенных объектов
При работе с нативным материалом необходимо соблюдать два основных принципа: не загрязнить исследуемый объект микроорганизмами, не заразить себя и окружающую среду. При микроскопии необходимо помнить, что рассматривание неокрашенного препарата возможно только с ограниченным освещением, путем опускания конденсора или уменьшением отверстия ирис-диафрагмы. Для микроскопии неокрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
При освещении с помощью встроенной подсветки осветителя или плоского зеркала ирис-диафрагма частично закрыта, конденсор опущен. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. С целью обнаружения объекта все нативные (неокрашенные) препараты просматривают под малым увеличением с помощью макровинта. Для лучшего рассмотрения объекта или его отдельных фрагментов используется сухой объектив с увеличением 40х и освещенность, с помощью поднятия конденсора и открытия ирис-диафрагмы под контролем глаза.

Микроскопия окрашенных объектов
При микроскопии окрашенного препарата необходимо помнить, что рассматривание возможно только при полном освещении. Для микроскопии окрашенных объектов используется окуляр 10х и объектив 10х.
Ирис-диафрагма открыта, конденсор поднят. С помощью макровинта устанавливается поле зрения и проводится обзор препарата. Достигается максимальное освещение препарата. При малом увеличении делается обзор препарата для обнаружения четко выраженных полей зрения. Изучение препарата проводится под большим увеличением с применением сухой системы объектив 40х. Для микроскопии окрашенных препаратов биологической жидкости, мокроты, биологического материала применяется иммерсионная система объектив 100х с нанесением на предметное стекло иммерсионного масла.

Метод люминесцентной микроскопии
Люминесценция, основа многих современных методов биологических исследований, позволяет наблюдать за взаимоотношениями молекул внутри клеток.
Фактором качественной работы для всех методов люминесцентных исследований является скорость.
Основной целью современной люминесцентной микроскопии является визуализация всех измерений объекта.
Метод с большим эффектом может быть использован для ускорения диагностики ряда заболеваний.
Люминесцентная микроскопия основана на способности некоторых веществ светиться под действием коротковолновых лучей света. При этом длина волны излучаемого при люминесценции света всегда будет больше, чем длина волны света, возбуждающего люминесценцию. Так, если освещать объект синим светом, он будет испускать лучи красного, оранжевого, желтого или зеленого цвета.
Препараты для люминесцентной микроскопии окрашивают специальными светящимися люминесцентными красителями – флуорохромами. Центральная часть клеток и присутствующие в препарате посторонние микробные клетки не светятся.
Ускоренная диагностика, идентификация возбудителя, обнаружение специфических антител в биологическом материале, биологической жидкости и во внешней среде осуществляется методами МФА, МИФ с применением люминесцирующих сывороток:
- иммуноглобулины диагностические туляремийные люминесцирующие – диагностика туляремии;
- иммуноглобулины диагностические бруцеллезные люминесцирующие – диагностика бруцеллеза;
-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные соматические люминесцирующие – диагностика сибирской язвы;
-иммуноглобулины диагностические сибиреязвенные антиспоровые адсорбированные флуоресцирующие – диагностика сибирской язвы;
-иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие холерные адсорбированные лошадиные – диагностика холеры;
- антигенный препарат с хантавирусным антигеном - диагностика ГЛПС;
- иммуноглобулины диагностические флуоресцирующие для быстрой диагностики гриппа, ОРВИ.
Антигены, вирусы гриппа и другие возбудители ОРВИ в инфицированных клетках по их характерной локализации выявляются в результате взаимодействия антигенов с противовирусными антителами, маркированными флуоресцеинизотиоцианатом, методом МИФ. Метод иммунофлуоресцентного анализа (МИФ) является высоко чувствительным и специфичным качественным иммунодиагностическим тестом. К числу преимуществ метода относится его исключительная простота и возможность быстрого (за 1-2 часа) анализа клинических материалов с распознаванием широкого круга возбудителей, включая вирусы гриппа, парагриппа, респираторно-синцитиальный вирус, коронавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса.

Общий метод: наблюдение. Частный метод: микроскопирование.

Christine E. Farrar, Zac H. Forsman, Ruth D. Gates, Jo-Ann C. Leong, and Robert J. Toonen, Hawai"i Institute of Marine Biology at the University of Hawai"i, Manoa

No dyes or digital software produced the brilliant color of these corals-the glory is all their own. Fluorescent molecules, innate to the corals and to the red algae that live inside and nourish them, shine like Christmas lights under different wavelengths of light emitted by a confocal microscope.

When she saw the corals under the lens for the first time, "my jaw just dropped," says Ruth Gates, a coral biologist at the University of Hawai"i, Manoa, and the narrator of the video. "Most people think corals are inanimate rocks," she says. "We showcase how beautiful and dynamic they are as animals." In the video, which compiles the images into three-dimensional, time-lapse animations, corals extend and retract their glowing tentacles. Tiny creatures crawl over the corals, all part of a complex and threatened ecosystem. In the future, Gates says, it might be possible to use confocal microscopy to classify different coral species or diagnose coral disease by their fluorescent patterns. Prior to applying this technique, she says, "that was not even a facet in our thinking about coral biology."

В данной статье мы ознакомимся широко развитой методикой исследования разнообразных микроэлементов нашего мира - микроскопией. Здесь мы рассмотрим описание микроскопа, его предназначение, устройство, правила работы и исторические факты.

Ознакомление с приборами микроскопии

Микроскоп - это механизм, предназначение которого заключается в получении увеличенного изображения какого-либо объекта, а также в измерении структурных деталей, которых невозможно наблюдать невооруженным глазом.

Изобретение и создание разнообразных видов микроскопов позволило создать микроскопию - технологический метод практической эксплуатации этих приборов.

Исторические сведения

Кем был создан первый микроскоп в истории человечества, определить довольно проблематично. Впервые такой механизм был изобретен на рубеже шестнадцатого и семнадцатого веков. Вероятным изобретателем считают Захария Янсена, голландского ученого.

Будучи еще ребенком, Янсен используя дюймовую трубочку, установил на двух ее краях по одной выпуклой линзе. Увиденное заставило изобретателя создать нечто новое и улучшить его. Возможно, это обусловило изобретение первого в мире микроскопа, что произошло приблизительно в 1590 году.

Однако еще в 1538 г. итальянец Дж. Фракасторо, работая врачом, выдвинул предположение о комбинировании двух линз с целью создания еще большего увеличения изображений. Следовательно, его работа могла стать началом для появления первого микроскопа. Хотя термин был введен гораздо позже.

Другим первооткрывателем считается Галилео Галилей. Услышав приблизительно в 1609 г. о появлении такого увеличительного устройства и разобравшись в общей идее его механизма, уже в 1612 г. итальянский физик создал собственное массовое изготовление микроскопов. Название этому прибору дал академический друг Галилея, Джованни Фабер в 1613.

Уже в шестидесятых годах XVII века были получены данные о применении микроскопа в научной исследовательской деятельности. Первый это сделал Роберт Гук, занимавшийся наблюдением за устройством разнообразных растений. Именно он в работе «микрография» сделал зарисовки увиденного в микроскоп изображения. Он установил, что растительные организмы строятся из клеток.

Разрешающие способности

Одним из параметров микроскопа является его разрешающая способность. Различные виды микроскопов имеют, соответственно, разный показатель этой характеристики. Так что же это такое?

Разрешающая способность - это возможности прибора показывать четкое и качественное изображение, картинку двух расположенных рядом, фрагментов исследуемого объекта. Показатель степени углубления в микромир и общая возможность его исследования базируются именно на этой способности. Данную характеристику определяет длина волны излучения, которую используют в микроскопе. Главным ограничением является невозможность получения картинки объекта, размеры которого меньше размера длины излучения.

Ввиду написанного выше становится очевидно, что благодаря разрешающей способности мы можем получать четкое изображение деталей изучаемого объекта.

Основные параметры

К другим важным параметрам в строении микроскопа относятся его увеличение, насадки, размер предметного столика, возможности подсветки, оптическое покрытие и т. д.

Рассмотрим главный из перечисленных в этом пункте показателей - увеличение.

Увеличение - это общая способность микроскопа показывать изучаемые объекты в больших размерах, чем они есть на самом деле. Вычисление этого параметра можно произвести путем умножения объективного увеличения на окулярное. Данная возможность в оптических микроскопах доходит до 2000 крат, а электронный имеет увеличение в сотни раз больше, чем световой.

Основная характеристика микроскопа - это именно его разрешающая способность, а также увеличение. Поэтому при выборе такого прибора на эти показатели необходимо обратить особое внимание.

Составные элементы

Микроскоп, как и любой другой механизм, состоит из определенных деталей, среди которых выделяют:

предметный столик;
рукоятку переключения;
окуляр;
тубус;
держатель для тубуса;
микрометренный винт;
винт грубой наводки;
зеркальце;
подставку;
объектив;
стойку;
бинокулярную насадку;
оптическую головку;
конденсор;
светофильтр;
ирисовую диафрагму.

Ознакомимся с основными характеристиками образующих структур микроскопа.

Объектив - является средством определения полезного увеличения. Образуется из определенного количества линз. Увеличительные возможности указываются цифрами на его поверхности.

Окуляр - состоящий из двух-трех линз элемент микроскопа, увеличение которого обозначается на нем цифрам. Общий показатель увеличительных способностей прибора определяется путем перемножения показателя увеличения объектива на увеличение окуляра.

Осветительные устройства включают в себя зеркальце или электроосветитель, конденсор и диафрагмой, светофильтр и столик.

Механическая система образуется подставкой, коробочкой с микрометренным механизмом и винтом, тубусодержателем, винтом грубой наводки, конденсором, винтом перемещения конденсора, револьвером и предметным столиком.

Оптическая микроскопия

Среди существующих видов микроскопов выделяют несколько основных групп, характеризующихся определенными особенностями устройства и предназначения.

Глаз человека - это своего рода естественная оптическая система с определенными параметрами, например, разрешением. Разрешение, в свою очередь, характеризуется наименьшим показателем разности в расстоянии между составными компонентами объекта, за которым наблюдают. Важнейшим пунктом здесь является наличие визуального отличия между наблюдаемыми фрагментами. Ввиду того, человеческий глаз не в силах наблюдать естественным путем за микроорганизмами, как раз и были созданы подобные увеличительные приборы.

Оптические микроскопы позволяли работать с излучением, лежащем в диапазоне от 400 до 700 нм и с ближним ультрафиолетом. Это длилось до середины двадцатого века. Подобные приборы не позволяли получать разрешающую способность меньшую, чем полупериод волны излучения опорного типа. Вследствие этого микроскоп позволял наблюдать за структурами, расстояние между которыми было около 0.20 мкм, из чего следует, что максимальное увеличение могло достигать 2000 крат.

Микроскопы бинокулярного типа

Бинокулярный микроскоп - это устройство, при помощи которого можно получить объемное увеличенное изображение. Другое название таких приборов - стереомикроскопы. Они позволяют человеку четко различать детали исследуемых объемных объектов.

В бинокулярном микроскопе рассмотрение объекта происходит сквозь две линзы, независимые между собой. В настоящее время используются сразу 2 окуляра и 1 объектов. Отлично работают в условиях наличия проходящего и отраженного света.

Электронная микроскопия

Появление электронного микроскопа позволило использовать электроны, обладающие свойствами и частиц, и волн в микроскопии.

Электрон обладает длинной волны, которая зависит от его энергетического потенциала: E = Ve, где V - величина разности потенциалов, e - электронный заряд. Длина волны электрона при пролете разности в потенциалах равной 200000 В составит около 0,1 нм. Электрон легко фокусируется при помощи электромагнитных линз, что обуславливается его зарядом. После электронную версию изображения переводят в видимую.

Среди таких увеличительных устройств набрал широкую известность цифровой микроскоп. Он позволяет подключать адаптеры к аппарату с целью переноса изображения на компьютер и его сохранения. При работе с подобными устройствами камера регистрирует наблюдаемое изображение, далее переносит его на ПК при помощи USB-кабеля.

Цифровой микроскоп может классифицироваться в соответствии с его режимом работы, увеличительной кратности, числу подсветок и разрешению камеры. Их главными достоинствами считаются наличие возможности переносить изображение на ПК и сохранять его, возможность в пересылке полученной информации на большие расстояния, редактирование, детальный анализ и хранение результатов исследования, а также умение проецировать картинку при помощи проекторов.

Электронные микроскопы обладают разрешающей способностью превосходящей световые в 1000-10000 раз.

Сканирующие зонды

Другой вид микроскопа - это сканирующий зонд. Сравнительно новая ветвь в развитии таких приборов.

Сокращенно их называют - ЗСМ. Изображение воспроизводится благодаря регистрации взаимодействия зонда и поверхности, которую он исследует. В современном мире такие механизмы позволяют наблюдать за взаимодействием зонда с атомами. Разрешающая способность ЗСМ сопоставима с микроскопами электронного типа, а в некоторых параметрах даже лучше.

Рентгеновская микроскопия

Рентгеновский микроскоп был создан для наблюдением за чрезвычайно малыми объектами, величина которых сопоставима с рентгеновскими волнами. Базируется на эксплуатации излучения электромагнитного характера, в котором длина волны не превышает один нанометр.

Разрешающая способность таких микроскопов заняла промежуточное место между оптическими и электронными. Теоретическая р.с. такого устройства может достигать 2-20 нм, что гораздо больше возможностей оптических микроскопов.

Общие сведения для работы с микроскопом

Эксплуатируя данный прибор необходимо знать правила работы с микроскопом:

Работу необходимо выполнять сидя.
Следует осмотреть прибор и протереть от пыли мягкими салфетками зеркальце, объектив и окуляр.
При работе с микроскопом нежелательно его передвигать, поставить слева от себя.
Произвести открытие диафрагмы, привести конденсор к верхнему положению.
Работу стоит начинать с малого увеличения.
Объектив довести до одного сантиметра от стекла с наблюдаемым объектом.
Равномерно распределить освещение поля зрения, используя окуляр, в который необходимо смотреть глазом, и вогнутое зеркало.
Переместить микропрепарат на столик микроскопа. Наблюдая сбоку, опустить объектив до уровня 4-5 мм над исследуемым объектом, используя для этого макровинт.
Глядя глазом в окуляр, производить вращательные движения грубого винта, для подведения объектива к положению, в котором будет четко видно изображение.
Перемещая стекло с препаратом, найдите место, где исследуемый объект будет располагаться по центру вашего поля зрения в микроскопе.
В случае отсутствия изображения, повторите с шестого по девятый пункты.
Используя микрометренный винт, добейтесь необходимой четкости изображения. Обратит внимание на то, не выходит ли точка между рисками на микрометренном механизме, за пределы рисок. Если выходит, то верните ее в стандартное положение.
Заключаем правила работы с микроскопом, уборкой рабочего места. Необходимо вернуть увеличение с большого на малое, произвести поднятие объектива, снять препарат и протереть микроскоп, далее накрыть полиэтиленом и вернуть в шкафчик.

Данные правила в большей мере относятся к оптическим микроскопам. Строение микроскопа, например, электронного или рентгеновского, отличается от светового, а потому основные правила работы могут также отличаться. Особенности работы с такими устройствами можно найти в инструкции к ним.

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ - способы изучения микроскопического строения различных объектов, размеры к-рых находятся за пределами разрешающей способности глаза. М. м. и. играют важную роль в бактериол., вирусол., цитол., гематол., гистол, и других исследованиях; их применяют также в фармакологии, химии, минералогии, кристаллографии и др. Среди М. м. и. наряду с обычной световой микроскопией широко используют стереоскопическую, темнопольную, интерференционную, фазово-контрастную, поляризационную, ультрафиолетовую, электронную микроскопию и др.

Основой для развития М. м. и. явились работы Аббе (Е. К. Abbe) но дифракционным свойствам электромагнитного излучения. С помощью теории Аббе определяют разрешающую способность микроскопов и изготавливают линзы, лишенные хроматической и сферической аберрации, объективы, дифракционные решетки, осветительный и рисовальный аппараты.

Дифракционная решетка Аббе служит для изучения явлений дифракции и состоит из системы тонких прозрачных и непрозрачных чередующихся линий, к-рые прорезают специальным резцом в толще металлического покрытия, нанесенного на стеклянную подложку.

Осветительный аппарат Аббе применяют в микроскопах для освещения объекта в проходящем свете. Он состоит из зеркала (плоского или вогнутого) и конденсора, посредством к-рых поток света направляют в плоскость объекта в виде сходящегося пучка лучей, что обеспечивает более высокую освещенность препарата и улучшает разрешающую способность микроскопа. Конденсор состоит, как правило, из двух-трех линз; ближнюю к объективу линзу устанавливают так, чтобы ее плоская поверхность была параллельна плоскости предметного столика микроскопа. При удалении конденсора от плоскости объекта яркость освещения снижается, однако возрастает контрастность изображения.

Рисовальный аппарат Аббе служит для зарисовки с гистол, препаратов. Он состоит из расположенной над окуляром микроскопа системы стеклянных призм, к-рая направляет в глаз исследователя световые лучи, прошедшие через гистол, препарат и отраженные с помощью зеркала от листа бумаги, лежащей возле микроскопа. Благодаря этому наблюдатель видит совмещенное изображение препарата и своей руки, очерчивающей, напр., карандашом контуры деталей гистол, картины препарата.

При пользовании М. м. и. важное значение приобретает правильная установка освещения, к-рую обычно проводят по методу Келера. Для этого автономный осветитель, напр. ОИ-19, располагают так, чтобы плоскость ирисовой диафрагмы осветителя находилась на расстоянии 15-25 см от центра зеркала микроскопа. Затем через закрытую на 1/2-1/3 диафрагму проецируют изображение нити лампы накаливания осветителя в центр зеркала микроскопа, прикрытого для облегчения наблюдения листом белой бумаги. Изменяя расстояние между микроскопом и осветителем, производят фокусировку изображения нити накаливания и затем зеркалом микроскопа направляют изображение в его объектив. При этом величина освещенного пятна должна совпадать с диаметром апертурной диафрагмы микроскопа, резкое изображение к-рой можно получить, изменяя положение конденсора и плоскости зеркала. В заключение раскрывают апертурную диафрагму микроскопа и с помощью макро- и микровинтов микроскопа получают яркое и четкое изображение объекта.

При работе с малыми увеличениями микроскопа этот способ не всегда позволяет получить полное и равномерное освещение поля зрения. В этих случаях снимают или отводят в сторону фронтальную линзу конденсора, применяют конденсор с большим фокусным расстоянием. При широко открытой апертурной диафрагме микроскопа изображение бывает недостаточно контрастным. В процессе диафрагмирования увеличивается контрастность изображения и возрастает глубина резкости, но может снизиться разрешающая способность микроскопа за счет нарастающих при этом дифракционных явлений. При смене объектива изображение следует снова сфокусировать в фокальной плоскости при закрытой диафрагме осветителя. В случае отклонения оси осветителя от оси объектива микроскопа края изображения могут быть освещены неодинаково. Чтобы освещенность краев изображения стала одинаковой и равномерной по всей площади поля зрения, наблюдая изображение через окуляр, перемещают осветитель.

Установку освещения по методу Келера применяют также при изучении препаратов в так наз. темном поле. В этом случае заменяют обычный конденсор темнопольным и, наблюдая в окуляр, медленно поднимают конденсор до возникновения темнопольного изображения.

Объекты, изучаемые под микроскопом, могут быть прозрачными, а также непрозрачными, т. е. изменяющими амплитудные и фазовые свойства направленного на них электромагнитного излучения. В зависимости от свойств объекта изменяются физ. свойства света - цвет (длина волны), яркость (амплитуда волны), фаза, плоскость и направление распространения волны, что используют в М. м. и. Для микроскопического исследования окрашенных объектов применяют световой микроскоп. Цвет изображения и различия в окраске нередко позволяют судить о хим. природе отдельных структур изучаемого объекта, но не дают возможности оценить его жизнедеятельность (движение, хемотаксис, слияние и др.), т.к. при окраске часто используют хим. или температурную фиксацию, убивающую биол, объект, но обеспечивающую эффективное окрашивание. В отличие от исследования фиксированных биол, объектов, витальная микроскопия основана на прижизненном окрашивании, в результате к-рого многие структуры живой клетки мало изменяются под действием специальных красителей. Витальная микроскопия может проводиться и без окрашивания, если в обычный световой микроскоп ввести темнопольный конденсор.

Ультрафиолетовая микроскопия используется в цитол, и гистохимических исследованиях. Она позволяет изучать локализацию, количественное распределение в клетках и тканях высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты) и наблюдать за их динамикой в процессе жизнедеятельности. Этот метод дает возможность без предварительной фиксации и окраски препаратов рассматривать исследуемый материал, напр., с целью прижизненного изучения микрообъектов.

Ультрафиолетовая абсорбционная микроскопия основана на способности нек-рых веществ, входящих в состав тканей и клеток, прозрачных в видимом свете, поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны.

При исследовании живых или фиксированных неокрашенных объектов возрастает контрастность изображения за счет избирательного поглощения ультрафиолетовых лучей высокомолекулярными соединениями. В частности, важное значение ультрафиолетовая микроскопия имеет для изучения распределения в клетке нуклеиновых к-т, поглощающих ультрафиолетовое излучение в участке спектра ок. 260 нм. Поглощение ультрафиолетового излучения белками зависит от входящих в их состав ароматических аминокислот (тирозина, триптофана, фенилаланина), дающих максимум поглощения в участке спектра ок. 280 нм. Для получения наглядного представления о распределении в препарате веществ изучаемый участок фотографируют в ультрафиолетовом свете с разной длиной волн. В последующем фотоснимки переснимают на цветную пленку в хромоскопе, в к-ром перед снимком, сделанным в коротковолновых лучах, помещают синий светофильтр, в лучах средней длины - зеленый и в длинноволновых лучах - красный светофильтр. Эти снимки с помощью специального приспособления совмещают на экране, и изображение становится видимым, передавая условными цветами различия поглощения ультрафиолетовых лучей отдельными структурами клетки.

Ультрафиолетовую флюоресцентную микроскопию, как и абсорбционную, используют для цитохим, изучения живых или фиксированных неокрашенных объектов, в связи с тем что спектры ультрафиолетовой флюоресценции веществ отличаются друг от друга.

Инфракрасная микроскопия дает возможность установить структуру объекта по характеру поглощения света с длиной волн 800-1000 нм. Широкое распространение имеет исследование в инфракрасном свете веществ, частично или полностью непрозрачных в ультрафиолетовой и видимой областях спектра. Для инфракрасной микроскопии биол, объекты не подвергают дополнительной хим. обработке. При помощи инфракрасного микроскопа производят исследование импрегнированной нервной ткани и капилляров в гистол, срезах, распознают повреждения сетчатки и радужной оболочки глаза.

Для повышения разрешающей способности М. м. и. создают оптические системы, основанные на электромагнитных линзах с применением в качестве источника излучения потока электронов, напр, для электронной микроскопии (см.) используют пучок быстрых электронов, а роль линз выполняют электрические и магнитные поля определенной конфигурации. Разновидностью электронной микроскопии является сканирующая (растровая) микроскопия, к-рая дает возможность получить объемное изображение объекта за счет излучаемых им вторичных электронов.

В нек-рых микроскопах плавное, бесступенчатое увеличение без смены объектива позволяет в пределах широкого диапазона установить интересующие детали объекта, напр, динамику биол, процессов, происходящих в тканевых культурах.

Библиография: Аппельт Г. Введение в методы микроскопического исследования, пер. с нем., М., 1959, библиогр.; Биофизические методы исследования, под ред. Ф. Юбера, пер. с англ., М., 1956; Д e Робертис Э., Новинский В. и Саус Ф. Биология клетки, пер. с англ., с. 94, М., 1973; Дитчберн Р. Физическая оптика, пер. с англ., М., 1965; Ильин P. С., Федотов Г. И. и Федин Л. А. Лабораторные оптические приборы, М., 19 66, библиогр.; Л и л л и Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия, пер. с англ., с. 7, М., 1969; Скворцов Г. Е. и д р. Микроскопы, Л., 1969, библиогр.

Н. К. Пермяков, Г. М. Могилевский.

Микроскопические методы исследования представляют собой способы изучения разнообразных объектов с использованием специального оборудования. Оно позволяет рассматривать строение веществ и организмов, величина которых находится за границами разрешающей способности человеческого взгляда. В статье проведем краткий анализ микроскопических методов исследования.

Общие сведения

Современные методы микроскопического исследования используют в своей практике разные специалисты. Среди них вирусологи, цитологи, гематологи, морфологи и прочие. Основные методы известны достаточно давно. В первую очередь это световой способ рассмотрения объектов. В течение последних лет активно вводятся в практику и другие технологии. Так, популярность приобрели фазово-контрастный, люминесцентный, интерференционный, поляризационный, инфракрасный, ультрафиолетовый, стереоскопический метод исследования . Все они базируются на разнообразных свойствах света. Кроме этого, широко используются электронно-микроскопические методы исследования . Эти способы позволяют отобразить объекты с помощью направленного потока заряженных частиц. Стоит отметить, что такие приемы изучения применяются не только в биологии и медицине. Достаточно популярен в промышленности. Такое изучение позволяет оценивать поведение соединений, вырабатывать технологии для минимизации вероятности разрушения и усиления прочности.

Световые способы: характеристика

Такие микроскопические методы исследования микроорганизмов и других объектов базируются на различной оборудования. Немаловажными факторами при этом является направленность луча, особенности самого объекта. Последний, в частности, может быть прозрачным или непрозрачным. В соответствии со свойствами объекта, меняются физические свойства светового потока - яркость и цвет, обусловленные амплитудой и длиной волны, плоскость, фаза и направленность распространения волны. На использовании этих характеристик и строятся разные .

Специфика

Для изучения световыми способами объекты, как правило, окрашивают. Это позволяет выявить и описать те или иные их свойства. При этом необходимо, чтобы ткани были фиксированными, поскольку окраска выявит определенные структуры исключительно в убитых клетках. В живых элементах краситель обосабливается в виде вакуоли в цитоплазме. Она не прокрашивает структуры. Но с помощью светового микроскопа можно исследовать и живые объекты. Для этого используется витальный способ изучения. В таких случаях применяется темнопольный конденсор. Он встраивается в световой микроскоп.

Изучение неокрашенных объектов

Оно осуществляется с помощью фазово-контрастной микроскопии. Этот способ базируется на дифракции луча в соответствии с особенностями объекта. В процессе воздействия отмечается изменение фазы и длины волны. В объективе микроскопа присутствует полупрозрачная пластинка. Живые или фиксированные, но не окрашенные объекты из-за своей прозрачности почти не изменяют цвет и амплитуду луча, проходящего сквозь них, провоцируя только сдвиг волновой фазы. Но при этом, пройдя через объект, световой поток отклоняется от пластинки. В итоге между лучами, пропущенными сквозь объект, и входящими в световой фон, появляется разность волновой длины. При определенном ее значении возникает визуальный эффект - темный объект будет четко виден на светлом фоне либо наоборот (в соответствии с особенностями фазовой пластинки). Для его получения разность должна составлять не меньше 1/4 длины волны.

Аноптральный способ

Интерференционные приемы

Эти решают в целом те же задачи, что и фазово-контрастные. Однако в последнем случае специалисты могут наблюдать только контуры объектов. Интерференционные микроскопические методы исследования позволяют изучать их части, выполнять количественную оценку элементов. Это возможно благодаря раздвоению светового луча. Один поток проходит сквозь частицу объекта, а другой - мимо. В окуляре микроскопа они сходятся и интерферируют. Возникающая разность фаз может определяться по массе разных клеточных структур. При последовательном ее измерении с заданными можно установить толщину нефиксированных тканей и живых объектов, содержание белков в них, концентрацию сухого вещества и воды и пр. В соответствии с полученными данными специалисты получают возможность косвенно оценивать проницаемость мембран, активность ферментов, клеточный метаболизм.

Поляризация

Она осуществляется с помощью призм Николя или пленчатых поляроидов. Их помещают между препаратом и источником света. Поляризационный микроскопический метод исследования в микробиологии позволяет изучать объекты с неоднородными свойствами. В изотропных структурах быстрота распространения света не зависит от выбранной плоскости. При этом в анизотропных системах скорость изменяется в соответствии с направленностью света по поперечной либо продольной оси объекта. В случае если величина преломления вдоль структуры будет больше, чем вдоль поперечной, создается двойное положительное лучепреломление. Это свойственно многим биологическим объектам, у которых обнаруживается строгая молекулярная ориентация. Они все являются анизотропными. К этой категории, в частности, относятся миофибриллы, нейрофибриллы, реснички в мерцательном эпителии, коллагеновые волокна и прочие.

Значение поляризации

Сравнение характера лучевого преломления и показателя анизотропии объекта дает возможность оценивать молекулярную организацию структуры. Поляризационный метод выступает как один из гистологических способов анализа, используется в цитологии и пр. В свете можно изучать не только окрашенные объекты. Поляризационный метод дает возможность исследовать неокрашенные и нефиксированные - нативные - препараты тканевых срезов.

Люминесцентные приемы

Они базируются на свойствах некоторых объектов давать свечение в сине-фиолетовом участке спектра или в УФ-лучах. Многие вещества, например белки, некоторые витамины, коферменты, лекарственные средства, наделены первичной (собственной) люминесценцией. Другие объекты начинают светиться при добавлении флюорохромов - специальных красителей. Эти добавки избирательно или диффузно распространяются на отдельные клеточные структуры или химические соединения. Это свойство легло в основу использования люминесцентной микроскопии при гистохимических и

Области использования

Применяя иммуно-флуоресценцию, специалисты обнаруживают вирусные антигены и устанавливают их концентрацию, идентифицируют вирусы, анти тела и антигены, гормоны, разнообразные продукты метаболизма и так далее. В этой связи при диагностике герпеса, эпидемического паротита, вирусного гепатита, гриппа и прочих инфекций используются люминесцентные методы исследования материалов. Микроскопический иммуно-флуоресцентный способ позволяет распознавать опухоли злокачественного характера, определять ишемические участки в сердце на ранних этапах инфаркта и пр.

Использование ультрафиолета

Оно основывается на способности ряда веществ, включенных в живые клетки, микроорганизмы или фиксированные, но неокрашенные, прозрачные при видимом свете ткани поглощать УФ-лучи определенной длины волн. Это характерно, в частности, для высокомолекулярных соединений. К ним относят белки, ароматические кислоты (метилаланин, триптофан, тирозин и пр.), нуклеиновые кислоты, пирамидиновые и пуриновые основания и так далее. Ультрафиолетовая микроскопия позволяет уточнить локализацию и количество этих соединений. При изучении живых объектов специалисты могут наблюдать изменения процессов их жизнедеятельности.

Дополнительно

Инфракрасная микроскопия используется при исследовании непрозрачных для света и УФ-лучей объектов посредством поглощения их структурами потока, длина волны которого 750-1200 нм. Чтобы применить этот способ нет необходимости предварительно подвергать препараты химической обработке. Как правило, инфракрасный метод используется в антропологии, зоологии и прочих биологических отраслях. Что касается медицины, то этот способ применяют преимущественно в офтальмологии и нейроморфологии. Изучение объемных объектов осуществляется с помощью стереоскопической микроскопии. Конструкция оборудования позволяет выполнять наблюдение левым и правым глазом под различным углом. Непрозрачные объекты исследуются при сравнительно небольшом увеличении (не более 120 раз). Стереоскопические способы используются в микрохирургии, патоморфологии, в судебной медицине.

Электронная микроскопия

Она используется для изучения структуры клеток и тканей на макромолекулярном и субклеточном уровнях. позволила сделать качественный скачок в сфере исследований. Этот способ широко применяется в биохимии, онкологии, вирусологии, морфологии, иммунологии, генетике и прочих отраслях. Значительное усиление разрешающей способности оборудования обеспечивается потоком электронов, которые проходят в вакууме сквозь электромагнитные поля. Последние, в свою очередь, создаются специальными линзами. Электроны обладают способностью проходить сквозь структуры объекта либо отражаться от них с отклонениями под разными углами. В результате создается отображение на люминесцентном экране прибора. При просвечивающей микроскопии получается плоскостное изображение, при сканирующей, соответственно, объемное.

Необходимые условия

Стоит отметить, что перед тем, как пройти электронное микроскопическое исследование, объект подвергается специальной подготовке. В частности, используется физическая либо химическая фиксация тканей и организмов. Секционный и биопсийный материал, кроме этого, обезвоживают, внедряют в эпоксидные смолы, разрезают алмазными или стеклянными ножами на ультратонкие срезы. Затем их контрастируют и изучают. В сканирующем микроскопе исследуются поверхности объектов. Для этого на них напыляют специальные вещества в вакуумной камере.