Методические рекомендации по изучению теоретического материала по курсу «Частная медицинская вирусология. Вирусологи́ческие ме́тоды иссле́дования Оценка результатов серологического и вирусологического исследования

Архив сайтов Internet Archive Wayback Machine Очень часто нападение черных пиарщиков происходит неожиданно для вас. В таком случае вы впервые сталкиваетесь с необходимостью пристального изучения противника. В случае если вы даже предполагали подобное развитие событий (например, в

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine

4.9. Резервное копирование с помощью Time Machine Операционная система Mac OS X Leopard позволяет выполнять регулярное резервное копирование данных на вашем компьютере с помощью приложения Time Machine (Машина времени). После соответствующих настроек приложение автоматически будет

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine

4.9.2. Создание первой резервной копии с помощью Time Machine Прежде чем перейти к созданию первой резервной копии, следует вставить внешний диск или иметь свободный раздел жесткого диска, отведенный только для резервного копирования.При подключении внешнего диска размером,

4.9.4. Использование Time Machine

4.9.4. Использование Time Machine Когда необходимые настройки Time Machine выполнены и создано некоторое количество резервных копий, можно приступить к поиску и восстановлению ранних версий файлов. Для этого:1. Откройте окно Finder и выделите файл, необходимый для восстановления.2. Если

ВИРУСОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ - исследования, проводимые с целью диагностики вирусных инфекций, изучения соответствующих возбудителей, их распространения в природе, а также при производстве вирусных препаратов. В вирусологических лабораториях (см.) мед. профиля изучают как вирусы человека, так в ряде случаев и вирусы животных (напр., проводят диагностику бешенства у собак, обследование животных, используемых для производства вирусных препаратов). Методы исследования тех и других сходны.

Одним из основных этапов В. и. является выделение вирусов. При выделении вирусов от людей используют кровь, различные секреты и экскреты, кусочки органов. Наиболее часто кровь исследуют при арбовирусных заболеваниях. Используется цельная дефибринированная или Гемолизированная кровь, отдельные ее элементы или сгустки (на поздних стадиях заболевания). Вирусы бешенства, эпид, паротита, простого герпеса могут быть обнаружены в слюне. Носоглоточные смывы служат для выделения возбудителей гриппа, кори, пситтакоза, риновирусов, респираторно-синцитиального вируса, аденовирусов. В смывах с конъюнктивы также обнаруживаются аденовирусы. Смыв берут путем полоскания носа и глотки (отдельно) и промывания конъюнктивы изотоническим раствором хлорида натрия. Можно протирать носовые ходы и заднюю стенку глотки тампонами, смоченными бульоном. Нестерильный материал обрабатывают антибиотиками (по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина на 1 мл) в течение 30 мин. Из фекалий выделяют различные энтеровирусы, адено- и реовирусы. Пробы разводят 1:10 фосфатным буфером, центрифугируют дважды по 20 мин. при 8000 об I мин. Антибиотики прибавляют, как указано выше. Реже для В. и. берут содержимое пустул (при оспе, ветрянке, герпесе) и пунктаты органов (при венерической лимфогранулеме). Секционный материал следует брать как можно скорее после гибели организма. Его хранят до момента исследования при t°-20° и ниже. Для проведения В. и. ткань измельчают (растирают) и готовят 10-20% взвесь на изотоническом растворе хлорида натрия или питательной среде для клеточных культур. Ее центрифугируют 20 мин. при 1500 об/мин; надосадочную жидкость используют для дальнейшего исследования.

С целью выделения вирусов заражают лабораторных животных, эмбрионы птиц, клеточные и тканевые культуры. Животные оказываются пригодными в том случае, если вирус вызывает у них четкие клинические симптомы заболевания или патологоанатомические изменения (напр., параличи, пневмонию и т. п.). От тропизма вируса зависит эффективность того или иного пути введения материала. Широко применяют заражение под кожу, внутрибрюшинно и внутривенно. Нейротропные вирусы выявляют при заражении животных в полушария головного мозга (арбовирусы, вирус бешенства и др.), зрительный бугор (вирус полиомиелита в опытах на обезьянах), спинной мозг. Вирусы оспы и герпеса можно обнаружить путем нанесения материала кроликам на скарифицированную роговицу. Некоторые вирусы легко выявить при инокуляции в переднюю камеру глаза (напр., вирус гепатита собак в опыте на щенках). Для изучения возбудителей респираторных инфекций обычно применяют интраназальное заражение животных (закапывание материала в нос наркотизированным животным или введение его в виде аэрозоля в специальной камере). В пищеварительный тракт материал вводят с пищей или через рот тупой иглой. При изучении некоторых онкогенных вирусов применяют метод заражения золотистых хомячков в слизистую оболочку защечных мешков.

Ко многим вирусам новорожденные животные и сосунки восприимчивее половозрелых особей. Мышей-сосунков широко используют для выделения арбовирусов и вирусов Коксаки (после заражения в мозг). Некоторые аденовирусы способны индуцировать опухоли при подкожном заражении новорожденных золотистых хомячков. Изучение ряда вирусов птиц проводят на цыплятах первых дней жизни.

Использование куриных эмбрионов имеет ряд преимуществ. Их недифференцированные ткани обладают широким спектром чувствительности в отношении многих вирусов. О наличии инфекции судят по гибели эмбрионов, появлению изменений (оспин) на хорион-аллантоисной оболочке (рис. 1), накоплению в эмбриональных жидкостях гемагглютининов и комплемент-связывающего вирусного антигена. Заражают эмбрионы на хорионаллантоисную оболочку (в возрасте 11 - 12 дней вирусами группы оспы), в аллантоисную и амниотическую полости (10-11-дневными миксовирусами), желточный мешок (в возрасте 5-6 дней возбудителями пситтакозаорнитоза и др.). Инокуляцию материала эмбрионам в мозг и внутривенно (в сосуды оболочек) производят редко. При любом способе заражения эмбрионы могут быть травмированы, поэтому погибших в первые 24-48 час. из учета исключают.

Для изучения действия на вирусы хим. веществ весьма удобны деэмбрионированные яйца, в которых удален эмбрион, но сохранена хорионаллантоисная оболочка. Внутрь помещают вирус и изучаемое вещество в 20 мл изотонического раствора хлорида натрия. Отверстие в скорлупе закрывают колпачком с трубочкой, через к-рую можно брать пробы для анализа.

При оценке опытов на животных и эмбрионах птиц следует иметь в виду возможность провокации у них латентных инфекций или выделения находящегося в латентном состоянии вируса.

Исключительно широко для выделения и накопления вирусов применяют культуры клеток и тканей (см.). Этими методами можно культивировать большинство известных вирусов (см. Культивирование вирусов). Некоторые из них интенсивно накапливаются уже при первичном заражении культур, для адаптации других требуется несколько пассажей. Размножение большинства вирусов в клеточных культурах сопровождается развитием цитопатического эффекта. По его характеру в известной степени можно судить о принадлежности вирусов к тому или иному роду: пикорнавирусы вызывают округление и сморщивание клеток, аденовирусы - образование округлившимися клетками скоплений в виде виноградных гроздьев, миксовирусы и герпетические вирусы - формирование многоядерных синцитиев. Ряд вирусов культивировать вне организма не удается.

Размножение некоторых вирусов (оспенная группа, миксо- и арбовирусы) можно обнаружить с помощью реакции гемадсорбции, поскольку пораженные клетки приобретают способность адсорбировать эритроциты. Соответствующие эритроциты (человека, обезьяны, морской свинки, курицы) в концентрации 0,4-0,5% помещают на монослой при t° 4° или при комнатной температуре на 20- 30 мин. Эритроциты адсорбируются диффузно по всей культуре (напр., парагриппозными вирусами) или формируют островки (вирусы гриппа, паротита).

О размножении вируса иногда судят путем исследования культуральной жидкости на животных (клещевой энцефалит) или в РСК. Наличие вируса, не обладающего цитопатической активностью, иногда определяют по его способности интерферировать с цитопатогенным вирусом. Так, в культурах клеток эмбрионов кур, инфицированных вирусами лейкозов птиц, подавляется размножение вируса саркомы Рауса. Для обнаружения нецитопатогенных штаммов вирусов диареи крупного рогатого скота и холеры свиней предложен метод END (exaltation of Newcastle disease virus) - суперинфицирование культур вирусом болезни Ньюкасла. При совместном действии обоих вирусов наступает разрушение клеток.

При появлении цитопатических изменений или других признаков размножения вируса культуральную жидкость используют для идентификации вируса или пассажа. Ряд вирусов остается связанным с клетками даже при дегенерации культуры (аденовирусы, вирусы группы оспы), вследствие чего производят замораживание и оттаивание культур перед сбором жидкости. Некоторые герпетические вирусы, напр, вирус болезни Марека у кур, необходимо пересевать вместе с неповрежденными клетками.

Для изучения респираторных корона-вирусов человека и некоторых других используют метод тканевых культур, т. е. заражение культивируемых in vitro тканевых фрагментов. Чаще всего используют ткань трахеи кролика. Размножающийся вирус поражает клетки эндотелия слизистой оболочки, что определяют по прекращению движения ресничек.

Следует учитывать возможность присутствия в культурах тканей и клеток посторонних вирусов. Они могут быть внесены с клетками, если последние взяты из инфицированного организма, попасть из трипсина или сыворотки, использованной для культивирования клеток.

Помимо посева биопсийного или секционного материала на уже выращенные культуры, применяют непосредственное культивирование клеток исследуемого органа после его трипсинизации, что нередко более эффективно в отношении выделения вируса (напр., обнаружение аденовирусов в миндалинах). Используют также методику смешанных культур, когда клетки исследуемого органа выращивают вместе с какими-либо чувствительными к данному вирусу клетками (напр., посев клеток мозга больных подострым склерозирующим панэнцефалитом вместе с клетками почек обезьян или Hela-клетками для выделения вируса кори). Метод смешанных культур является зачастую единственным способом выделения вируса из индуцированных им у животных опухолей, которые не продуцируют активного вируса, однако содержат вирусный геном.

Однослойные клеточные культуры дают возможность получить колонии вируса - бляшки (рис. 2). Как правило, бляшки формируют вирусы, обладающие цитопатической активностью. В то же время этот метод позволяет обнаруживать некоторые нецитопатогенные вирусы (напр., ряд штаммов вируса диареи крупного рогатого скота). Для получения бляшек вирус вносят на клеточный монослой в чашках или плоских флаконах. Множественность заражения, т. е. число вирусных частиц на одну клетку, должна быть небольшой, чтобы образовавшиеся бляшки не сливались. После 30-60 мин. адсорбции наслаивают питательную среду с 1,35 - 1,5% агара и нейтральным красным в конечном разведении 1: 40 000. Культуры в чашках Петри инкубируют в атмосфере с 5-10% углекислоты, а герметически закрытые флаконы - в обычном термостате. Через несколько дней среди прижизненно окрашенных клеток начинают выделяться неокрашенные фокусы из дегенерированных клеток.

Можно на клетки помещать агар без нейтрального красного, а через несколько дней нанести второй слой агара с красителем; бляшки становятся видимыми через несколько часов. Агар иногда содержит сульфаты полисахаридов, которые являются ингибиторами роста вирусов; для их нейтрализации в среду добавляют протамин-сульфат (60 мг на 100 мл). Для получения бляшек ряда вирусов можно использовать в качестве покрытия метилцеллюлозу и другие вещества. Некоторые вирусы (оспы, кори) формируют бляшки и без агарового покрытия. Метод бляшек позволяет провести клональный анализ вирусных штаммов. Для выделения генетически однородных клонов извлекают одну бляшку, к-рую используют для следующего заражения. Обычно клонирование проводят на протяжении трех пассажей.

Метод бляшек пригоден также для определения в зараженной культуре количества клеток, продуцирующих вирус (т. е. число инфекционных центров). Для этого клетки суспендируют, помещают на однослойную культуру чувствительных к вирусу индикаторных клеток и заливают агаром. Вокруг зараженных клеток формируются бляшки.

Для диагностики вирусных инфекций и изучения антигенной структуры вирусов применяется реакция преципитации в геле. Чаще всего с этой целью используют агар. Антигены и специфические антитела, помещенные в агаровый гель на определенном расстоянии, диффундируют и образуют при встрече преципитат в виде белых полос. 0,8-1% агар в изотоническом растворе хлорида натрия или фосфатном буфере помещают в капилляры или наносят слоем на предметные стекла. Антигены предпочтительно иметь очищенные и концентрированные. Ингредиенты реакции вносят на агар в противоположные концы капилляра или в лунки, сделанные в слое агара на стеклах на расстоянии 5-6 мм. Инкубация продолжается 4-20 час.

Значительное число В. и. выполняют с помощью световой и электронной микроскопии. Наиболее крупные вирусы (напр., оспы) после соответствующей обработки (серебрение, окраска викторияблау и др.) могут быть выявлены при обычной световой микроскопии. Этот метод применяют при диагностике оспы путем обследования материала из пустул. Характерным для некоторых инфекций является формирование в клетках телец - включений. Так, в ядрах появляются включения при герпетической и аденовирусной инфекции, в цитоплазме - при оспе (тельца Гуарниери) и бешенстве (тельца Бабеша- Негри). Обнаружение включений имеет значение для диагностики бешенства, оспы, цитомегалии, подострого склерозирующее панэнцефалита и др.

Микроскопию в темном поле (см. Темнопольная микроскопия) и фазово-контрастную микроскопию (см.) используют гл. обр. для изучения динамики изменений в пораженных вирусом клетках. Более широко применяют люминесцентную микроскопию (см.).

Исследуют мазки, отпечатки и выращенные на стеклах однослойные клеточные культуры. Препараты (нативные или фиксированные) чаще всего окрашивают акридином оранжевым. Метод позволяет выявлять крупные вирусы и скопления вирусных компонентов. Образования, содержащие ДНК, светятся ярко-зеленым светом, а содержащие РНК - кирпично-красным. Еще чаще при В. и. производят обработку зараженных клеток флюоресцирующими антителами, что позволяет выявить скопления вирусного антигена. При прямом методе используют иммунный гамма-глобулин, меченный флюоресцентным красителем, напр, флюоресцеин-изотиоцианатом. При непрямом методе препарат обрабатывают обычной иммунной сывороткой какого-либо животного, а затем мечеными антителами против гамма-глобулина этого животного. Препараты просматривают в ультрафиолетовом свете, вирусный антиген обнаруживают по светло-зеленому свечению (см. Иммунофлюоресценция). Метод мазков из носоглотки позволяет проводить раннюю диагностику респираторных вирусных инфекций - гриппозной, парагриппозной, рино- и аденовирусной, респираторно-синцитиальной.

Хим. состав вирусов исследуют общепринятыми хим. методами. Нуклеиновую к-ту обычно получают фенольной экстракцией, реже применяют анионные детергенты - додецил- или лаурилсульфат натрия.

Для идентификации вирусов (см.) в первую очередь следует установить их родовую принадлежность. Для этого необходимо определить размеры и структуру вирусных частиц, вид входящей в их состав нуклеиновой к-ты, наличие липоидной оболочки. Вид нуклеиновой к-ты чаще всего определяют косвенными методами, напр, используя способность бромдезоксиуридина подавлять размножение ДНК-содержащих вирусов. Наличие липоидной оболочки у вируса устанавливают по его чувствительности к действию эфира и хлороформа (имеющие оболочку вирусы инактивируются). Дальнейшую идентификацию проводят с набором иммунных сывороток к известным вирусам, используя различные реакции - нейтрализации, РСК, РТГА и др. Реже производят иммунизацию животных известным вирусом с дальнейшим их заражением неизвестным или наоборот.

Библиография: Лабораторная диагностика вирусных и риккетсиозных заболеваний, под ред. Э. Леннета и Н. Шмидт, пер. с англ., М., 1974, библиогр.; Лурия G. Е. и Д а р н e л л Дж. Е. Общая вирусология, пер. с англ., М., 1970, библиогр.; Методы вирусологии и молекулярной биологии, пер. с англ., М., 1972; П ш e н и ч-н о в В. А., Семенов Б.Ф. иЗезе-р о в Е. Г. Стандартизация методов вирусологических исследований, М., 1974, библиогр.; Руководство по лабораторной диагностике вирусных и риккетсиозных болезней, под ред. П. Ф. Здродовского и М. И. Соколова, М., 1965; Соколов М. И., С и н и ц к и й А. А. и Ремезов П. И. Вирусологические и серологические исследования при вирусных инфекциях, Л., 1972; Virologische Praxis, hrsg, v. G. Starke, Jena, 1968, Bibliogr.

Курсовая работа

"Методы клинической вирусологии"

Введение

Лабораторную диагностику вирусных инфекций проводят в основном с помощью электронной микроскопии, чувствительных культур клеток и иммунологическими методами. Как правило, для постановки диагноза выбирают какой-либо один метод в зависимости от стадии вирусной инфекции. Так, например, все три подхода могут оказаться полезными при диагностике ветряной оспы, однако успешное применение микроскопии и метода культуры клеток зависит от возможности сбора удовлетворительных образцов на относительно раннем этапе заболевания.

В большой степени успех вирусной диагностики зависит и от качества полученных образцов. По этой причине сами сотрудники лаборатории должны принимать непосредственное участие в сборе необходимых образцов. Характеристики образцов, а также способы их доставки в лабораторию описаны Леннетом, Шмидтом, Кристом и др.

Большинство реактивов и инструментов, используемых в лабораторной диагностике, можно приобрести у различных фирм. В большинстве случаев один и тот же реактив выпускается одновременно несколькими фирмами. По этой причине мы не указывали отдельные фирмы, кроме тех случаев, когда реактив поставляется только одной фирмой. Во всех остальных случаях следует обратиться к общему перечню поставщиков, указанных в табл. 1.

Мы не ставили своей целью всестороннее описание всех имеющихся в настоящее время методов диагностики вирусных инфекций человека. Прежде всего мы охарактеризовали основные методы. По мере накопления опыта самостоятельной работы эти основные методы можно будет использовать для решения более сложных задач.

1. Электронная микроскопия

Для электронно-микроскопической диагностики вирусных инфекций можно использовать тонкие срезы пораженной ткани. Чаще всего материалом для электронной микроскопии служат фекалии или жидкость

Таблица 1. Список фирм, поставляющих реактивы и оборудование

везикул, характеризующих некоторые болезни, например ветряную оспу. При анализе такого материала вирусы можно обнаружить с помощью негативного окрашивания, приводящего к очерчиванию компонентов вириона электронно-плотным материалом. Метод эффективен при высокой концентрации вируса в исследуемых образцах, как, например, в фекалиях или везикулярной жидкости. В тех случаях, когда содержание вирусных частиц в образцах невелико, вероятность обнаружения вируса можно увеличить, концентрируя вирус ультрацентрифугированием или агрегируя его специфическими антителами. Последний метод удобен и для идентификации вирусов. Здесь мы опишем электронно-микроскопический метод диагностики ротавирусной инфекции и метод иммуноэлектронной микроскопии на примере обнаружения специфических антител к парвовирусам. Более подробно методы электронной микроскопии изложены Филдом.

2.1 Прямое электронно-микроскопическое исследование фекалий

1. Конец пастеровской пипетки погружают в фекалии и набирают достаточное количество материала для получения мазка размером 1 см.

2. Ресуспендируют фекальный мазок в электронно-микроскопической краске для негативного контрастирования до получения полупрозрачной суспензии. Краска для негативного контрастирования представляет собой 2%-ный раствор фосфорно-вольфрамовой кислоты в дистиллированной воде.

3. Для получения электронно-микроскопического препарата капельку суспензии помещают на сетку для электронного микроскопирования, покрытую углеродно-формваровой пленкой. Во время этой операции сетку держат парой тонких пинцетов.

4. Препарат оставляют на воздухе на 30 с.

5. Излишки жидкости удаляют, прикасаясь к краю стекла фильтровальной бумагой.

6. Препарат высушивают на воздухе.

7. В случае необходимости жизнеспособный вирус инактиви-руют, облучая обе стороны сетки ультрафиолетом с интенсивностью 440 000 мкВт-с/см 2 . При этом используют коротковолновую ультрафиолетовую лампу с фильтром. Лампа должна находиться на расстоянии 15 см от сетки; время облучения каждой стороны - 5 мин.

8. Вирионы ротавирусов можно охарактеризовать под трансмиссионным электронным микроскопом с увеличением от 30 000 до 50 000.

2.2 Иммуноэлектронная микроскопия

Описанный ниже метод иммуноэлектронной микроскопии представляет собой только один из множества подобных иммунологических методов. Для исследования вирусоспецифических антител, кроме того, используют метод, предполагающий связывание с микроскопической сеткой белка А. Рабочую концентрацию антивирусных антител определяют методом проб и ошибок в диапазоне от 1/10 до 1/1000. Указанная нами концентрация, как правило, используется в рутинной работе. Для получения оптимальных результатов взаимодействия антител с вирусом таким же образом титруют сыворотку, содержащую парвовирус.

1. 10 мкл антисыворотки к парвовирусу человека в 100 раз разводят PBS. Раствор нагревают в водяной бане до 56°С.

2. Обычным способом расплавляют 10 мл 2%-ной агарозы в PBS и охлаждают до 56 °С в водяной бане.

3. При 56 °С смешивают 1 мл разведенной антисыворотки с 1 мл 2%-ной агарозы.

4. Переносят по 200 мкл полученной смеси в две лунки 96-луночного планшета для микротитрования.

5. Агарозе дают застыть при комнатной температуре. Планшет можно хранить при 4°С в течение нескольких недель, если заклеить его клейкой лентой.

6. В лунку, содержащую смесь агарозы с антисывороткой, вносят 10 мкл сыворотки, содержащей парвовирус.

7. Сетку для электронной микроскопии с заранее приготовленным углеродно-формваровым покрытием кладут менее блестящей стороной на каплю сыворотки.

8. Сетку выдерживают 2 ч при 37 °С во влажной камере.

9. Тонким пинцетом достают сетку и наносят каплю 2%-ной фосфорно-вольфрамовой кислоты на ту поверхность сетки, которая находилась в контакте с сывороткой.

10. Через 30 с отмывают избыток краски, высушивают препарат и инактивируют вирус.

Агрегированные вирусные частицы исследуют под трансмиссионным электронным микроскопом при увеличении от 30000 до 50000.

3. Идентификация вирусных антигенов

Вирусы, находящиеся в тканях или тканевых жидкостях, можно идентифицировать по вирусоспецифическим белкам с помощью реакции антиген - антитело. Продукт реакции антиген - антитело тестируют по метке, которую вводят либо непосредственно в антивирусные антитела, либо в антитела, направленные против вирусоспецифических антител. Антитела можно пометить флуоресцеином, радиоактивным иодом или ферментом, расщепляющим субстрат с изменением окраски. Кроме того, для идентификации вируса используют реакцию гемагглютинации. В повседневной практике описанные методы применяют главным образом для обнаружения в крови антигенов вируса гепатита В и поиска антигенов разных вирусов, вызывающих различные респираторные заболевания.

В настоящее время многими фирмами выпускаются эритроцитарные, радиоактивные и ферментативные диагностикумы, в том числе для обнаружения вируса гепатита В. Мы не считаем целесообразным излагать методы работы с указанными диагностикумами: вполне достаточно следовать прилагаемым инструкциям. Ниже мы остановимся на иммунофлуоресцентном методе идентификации респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях.

3.1 Идентификация респираторно-синцитиального вируса в носоглоточных выделениях методом иммунофлуоресценции

Метод получения препаратов носоглоточных выделений описан Гарднером и Мак-Квилином. В лабораторных условиях эта операция выполняется в два этапа. Сначала готовят мазок из носоглоточной слизи на предметном стекле. Полученные мазки можно хранить в фиксированном состоянии при -20 °С в течение многих месяцев. На втором этапе окрашивают мазки для выявления антигена респираторно-синцитиального вируса. Для этой цели используют метод непрямой иммунофлуоресценции.

3.1.1 Приготовление препаратов носоглоточных выделений

1. Слизь со специальных щипцов смывают 1-2 мл PBS и переносят в центрифужную пробирку.

2. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

3. Надосадочную жидкость сливают.

4. Осадок клеток осторожно ресуспендируют в 2-3 мл PBS до получения гомогенной суспензии. Для этого используют ши-рокогорлую пастеровскую пипетку.

5. Полученную суспензию переносят в пробирку.

6. К суспензии добавляют еще 2-4 мл PBS и перемешивают пипетированием. Крупные сгустки слизи удаляют.

7. Центрифугируют 10 мин при 1500 об/мин в настольной центрифуге.

8. Супернатант сливают, осадок ресуспендируют в таком объеме PBS, чтобы полученная суспензия легко отделялась от стенок пробирки.

9. Полученную суспензию наносят на размеченное предметное стекло.

10. Стекло подсушивают на воздухе.

Фиксируют в ацетоне 10 мин при 4°С.

12. После фиксации стекло опять подсушивают на воздухе.

13. Полученные препараты окрашивают немедленно либо хранят при -20 °С.

3.1.2. Методика окрашивания

1. Распечатывают и разводят в PBS коммерческую антисыворотку против РСВ до рекомендованной рабочей концентрации.

2. Пастеровской пипеткой наносят одну каплю антисыворотки на приготовленный препарат.

3. Препарат помещают во влажную камеру.

4. Препарат инкубируют 30 мин при 37 °С.

5. Образцы осторожно отмывают PBS от избытка антител в специальном резервуаре.

6. Отмывку образцов проводят в трех сменах PBS по 10 мин в каждой.

7. Образцы высушивают, удаляют избыток PBS фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе.

Вирусологи ческие ме тоды иссле дования — методы изучения биологии вирусов и их идентификации. В вирусологии широко используются методы молекулярной биологии, с помощью которых удалось установить молекулярную структуру вирусных частиц, способы проникновения их в клетку и особенности репродукции вирусов, первичной структуры вирусных нуклеиновых кислот и белков. Развиваются методы определения последовательности составляющих элементов вирусных нуклеиновых кислот и аминокислот белка. Появляется возможность связать функции нуклеиновых кислот и кодируемых ими белков с последовательностью нуклеотидов и установить причины внутриклеточных процессов, играющих важную роль в патогенезе вирусной инфекции.

Вирусологические методы исследования основаны также на иммунологических процессах (взаимодействие антигена с антителами), биологических свойствах вируса (способность к гемагглютинации, гемолизу, ферментативная активность), особенностях взаимодействия вируса с клеткой-хозяином (характер цитопатического эффекта, образование внутриклеточных включений и т.д.).

В диагностике вирусных инфекций, при культивировании, выделении и идентификации вирусов, а также при получении вакцинных препаратов широко применяют метод культуры ткани и клеток. Используют первичные, вторичные, стабильные перевиваемые и диплоидные клеточные культуры. Первичные культуры получают при диспергировании ткани протеолитическими ферментами (трипсином, коллагеназой). Источником клеток могут быть ткани и органы (чаще почки) эмбрионов человека и животных. Суспензию клеток в питательной среде помещают в так называемые матрацы, бутыли или чашки Петри, где после прикрепления к поверхности сосуда клетки начинают размножаться. Для заражения вирусами используют обычно клеточный монослой. Питательную жидкость сливают, вносят вирусную суспензию в определенных разведениях и после контакта с клетками добавляют свежую питательную среду, обычно без сыворотки.

Клетки большинства первичных культур могут быть пересеяны, такая культура называется вторичной. При дальнейшем пассировании клеток формируется популяция фибробластоподобных клеток, способных к быстрому размножению, большая часть которых сохраняет исходный набор хромосом. Это так называемые диплоидные клетки. При серийном культивировании клеток получают стабильные перевиваемые клеточные культуры. При пассажах появляются быстро делящиеся однородные клетки с гетероплоидным набором хромосом. Стабильные линии клеток могут быть однослойными и суспензионными. Однослойные культуры растут в виде сплошного слоя на поверхности стекла, суспензионные — в виде суспензий в различных сосудах с использованием перемешивающих устройств. Существует более 400 линий клеток, полученных от 40 различных видов животных (в т.ч. от приматов, птиц, рептилий, амфибий, рыб, насекомых) и человека.

В искусственных питательных средах можно культивировать кусочки отдельных органов и тканей (органные культуры). Эти типы культур сохраняют структуру ткани, что особенно важно для выделения и пассирования вирусов, которые не репродуцируются в недифференцированных тканевых культурах (например, коронавирусы).

В зараженных клеточных культурах вирусы можно обнаружить по изменению морфологии клеток, цитопатическому действию, которое может иметь специфический характер, появлению включений, путем определения вирусных антигенов в клетке и в культуральной жидкости; установления биологических свойств вирусного потомства в культуральной жидкости и титрования вирусов в культуре ткани, куриных эмбрионах или на чувствительных животных; путем выявления отдельных вирусных нуклеиновых кислот в клетках методом молекулярной гибридизации или скоплений нуклеиновых кислот цитохимическим методом с помощью люминесцентной микроскопии.

Выделение вирусов является трудоемким и длительным процессом. Его осуществляют с целью определения циркулирующего среди населения типа или варианта вируса (например, для идентификации сероварианта вируса гриппа, дикого или вакцинного штамма вируса полиомиелита и т.д.); в случаях, когда это необходимо для проведения срочных эпидемиологических мероприятий; при появлении новых типов или вариантов вирусов; при необходимости подтверждения предварительного диагноза; для индикации вирусов в объектах окружающей среды. При выделении вирусов учитывают возможность их персистирования в организме человека, а также возникновения смешанной инфекции, вызванной двумя и более вирусами. Генетически однородная популяция вируса, полученная от одного вириона, называется вирусным клоном, а сам процесс получения его — клонированием.

Для выделения вирусов применяют заражение восприимчивых лабораторных животных, куриных эмбрионов, но чаще всего используют культуру ткани. Наличие вируса обычно определяют по специфической дегенерации клеток (цитопатический эффект), образованию симпластов и синцитиев, обнаружению внутриклеточных включений, а также специфического антигена, выявляемого с помощью методов иммунофлюоресценции, гемадсорбции, гемагглютинации (у гемагглютинирующих вирусов) и т.д. Эти признаки могут обнаруживаться лишь после 2—3 пассажей вируса.

Для выделения ряда вирусов, например вирусов гриппа, используют куриные эмбрионы, для выделения некоторых вирусов Коксаки и ряда арбовирусов — новорожденных мышей. Идентификацию выделенных вирусов проводят с помощью серологических реакций и других методов.

При работе с вирусами определяют их титр. Титрование вирусов проводят обычно в культуре ткани, определяя наибольшее разведение вируссодержащей жидкости, при котором происходит дегенерация ткани, образуются включения и вирусоспецифические антигены. Для титрования ряда вирусов можно использовать метод бляшек. Бляшки, или негативные колонии вирусов, представляют собой очаги разрушенных под действием вируса клеток однослойной культуры ткани под агаровым покрытием. Подсчет колоний позволяет провести количественный анализ инфекционной активности вирусов из расчета, что одна инфекционная частица вируса образует одну бляшку. Бляшки выявляют путем окрашивания культуры прижизненными красителями, обычно нейтральным красным; бляшки не адсорбируют краситель и поэтому видны как светлые пятна на фоне окрашенных живых клеток. Титр вируса выражают числом бляшкообразующих единиц в 1 мл .

Очистку и концентрацию вирусов обычно осуществляют путем дифференциального ультрацентрифугирования с последующим центрифугированием в градиентах концентраций или плотности. Для очистки вирусов применяют иммунологические методы, ионно-обменную хроматографию, иммуносорбенты и т.д.

Лабораторная диагностика вирусных инфекций включает обнаружение возбудителя или его компонентов в клиническом материале; выделение вируса из этого материала; серодиагностику. Выбор метода лабораторной диагностики в каждом отдельном случае зависит от характера заболевания, периода болезни и возможностей лаборатории. Современная диагностика вирусных инфекций основана на экспресс-методах, позволяющих получать ответ через несколько часов после взятия клинического материала в ранние сроки после заболевания, К ним относятся электронная и иммунная электронная микроскопия, а также иммунофлюоресценция, метод молекулярной гибридизации, выявление антител класса lgM и др.

Электронная микроскопия вирусов, окрашенных методом негативного контрастирования, позволяет дифференцировать вирусы и определять их концентрацию. Применение электронной микроскопии в диагностике вирусных инфекций ограничивается теми случаями, когда концентрация вирусных частиц в клиническом материале достаточно высокая (10 5 в 1 мл и выше). Недостатком метода является невозможность отличать вирусы, принадлежащие к одной таксономической группе. Этот недостаток устраняется путем использования иммунной электронной микроскопии. Метод основан на образовании иммунных комплексов при добавлении специфической сыворотки к вирусным частицам, при этом происходит одновременная концентрация вирусных частиц, позволяющая идентифицировать их. Метод применяют также для выявления антител. В целях экспресс-диагностики проводят электронно-микроскопическое исследование экстрактов тканей, фекалий, жидкости из везикул, секретов из носоглотки. Электронную микроскопию широко используют для изучения морфогенеза вируса, ее возможности расширяются при применении меченых антител.

Метод молекулярной гибридизации, основанный на выявлении вирусоспецифических нуклеиновых кислот, позволяет обнаружить единичные копии генов и по степени чувствительности не имеет себе равных. Реакция основана на гибридизации комплементарных нитей ДНК или РНК (зондов) и формировании двунитчатых структур. Наиболее дешевым зондом является клонированная рекомбинантная ДНК. Зонд метят радиоактивными предшественниками (обычно радиоактивным фосфором). Перспективно использование колориметрических реакций. Существует несколько вариантов молекулярной гибридизации: точечная, блот-гибридизация, сэндвич-гибридизация, гибридизация in situ и др.

Антитела класса lgM появляются раньше, чем антитела класса G (на 3—5-й день болезни) и исчезают через несколько недель, поэтому их обнаружение свидетельствует о только что перенесенной инфекции. Антитела класса lgM выявляют методом иммунофлюоресценции или с помощью иммуноферментного анализа, используя анти- m -антисыворотки (сыворотки против тяжелых цепей lgM).

Серологические методы в вирусологии основаны на классических иммунологических реакциях (см. Иммунологические методы исследования ): реакции связывания комплемента, торможения гемагглютинации, биологической нейтрализации, иммунодиффузии, непрямой гемагглютинации, радиального гемолиза, иммунофлюоресценции, иммуноферментного, радиоиммунного анализа. Разработаны микрометоды многих реакций, техника их непрерывно совершенствуются. Эти методы используют для идентификации вирусов с помощью набора известных сывороток и для серодиагностики с целью определения нарастания антител во второй сыворотке по сравнению с первой (первую сыворотку берут в первые дни после заболевания, вторую — через 2—3 нед.). Диагностическое значение имеет не менее чем четырехкратное нарастание антител во второй сыворотке. Если выявление антител класса lgM свидетельствует о недавно перенесенной инфекции, то антитела класса lgC сохраняются в течение нескольких лет, а иногда и пожизненно.

Для идентификации индивидуальных антигенов вирусов и антител к ним в сложных смесях без предварительной очистки белков используют иммуноблоттинг. Метод сочетает фракционирование белков с помощью электрофореза в полиакриламидном геле с последующей иммуноиндикацией белков иммуноферментным методом. Разделение белков снижает требования к химической чистоте антигена и позволяет выявлять индивидуальные пары антиген — антитело. Такая задача актуальна, например, при серодиагностике ВИЧ-инфекции, где ложноположительные реакции иммуноферментного анализа обусловлены наличием антител к клеточным антигенам, которые присутствуют в результате недостаточной очистки вирусных белков. Идентификация антител в сыворотках больных к внутренним и наружным вирусным антигенам позволяет определять стадию заболевания, а при анализе популяций — изменчивость вирусных белков. Иммуноблоттинг при ВИЧ-инфекции применяют как подтверждающий тест для выявления индивидуальных вирусных антигенов и антител к ним. При анализе популяций метод используют для определения изменчивости вирусных белков. Большая ценность метода заключается в возможности анализа антигенов, синтезируемых с помощью технологии рекомбинантных ДНК, установлении их размеров и наличия антигенных детерминант.